Name: visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

وأيد هذا العمل الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث (01EO1003 الألمانية والألمانية 01EO1503).

وقد أجريت تجارب على الفئران الذكور سن 8 إلى 12 أسبوعا القديمة تحت موافقة لجنة الأخلاقيات في التجارب الحيوانية من راينلاند بالاتينات (ترخيص رقم 23 177-07/G12-1-002 و 23 177-07/مجموعة ال 15-1-051).
1-التخدير والجراحة إعداد الماوس
<ol>
	<li>قبل الجراحة، والتحقق من صحة جيدة وشرط للحيوانات. قبل الجراحة، ومراقبة الحيوانات مرة واحدة يوميا لمدة 2-3 أيام لحالتهم العامة (المظهر، والموقف، والسلوك العفوي) فضلا عن وزن الجسم والغذاء واستهلاك المياه.</li>
	<li>إعداد مزيج الرئيسي للتخدير مع الميدازولام (5 ملغ/كغ من وزن الجسم)، ميديتوميديني (0.5 ملغ/كغ من وزن الجسم) وشيفتشنكو (0.05 مغ/كغ من وزن الجسم) إلى إينترابيريتونيلي (القائمة) حقن 200 g ميكروليتر/30 الماوس في 1 مل حقنه بإبرة ز 26.</li>
	<li>وتجري غرس مضخة ناضح وإعداد الحيوان لإجراء التجارب على ناقلات الأمراض على حقل عملية مع 39 درجة مئوية الاحترار منصة. تعقيم كل الأدوات في حمام تعقيم وتطهير منهاج الاحترار.</li>
	<li>وخلال الإجراءات، حماية عيون الحيوان مع مرهم العين. إزالة الفراء مع شفرات الحلاقة قبل غرس مضخة ناضح. استخدام كريم إزالة شعر ومسحات القطن لعزل كاروتيدس وزرع قسطرة jugular في تجارب ناقلات الأمراض. تطهير الجلد الحيوان باستخدام اثنين من المطهرات الجلد: الجلد مطهر واحد والمطهرات التي تحتوي على مادة اليود البوفيدون وواحد أوكتينيديني تحتوي على مطهر في الحل القائم على الكحول.</li>
	<li>إعداد مزيج الرئيسي استعداء التخدير ("ميكس أنتيسيدان") مع أتيباميزول (0.05 مغ/كغ من وزن الجسم) وفلومازينيل (0.01 ملغ/كجبودي الوزن)، وإعداد 200 ميليلتر/الماوس في 1 مل حقنه بإبرة ز 26 لتكون تحت الجلد حقن (الليبي).</li>
</ol>
2. إعداد مضخة ناضح وغرس
ملاحظة: ضخ أنجيي تحت الجلد باستخدام مضخات ناضح وصفت بالتفصيل لو et al. 17
<ol>
	<li>إعداد أنجيي بإعادة تشكيل المساحيق المجففة بالتبريد مع المحلول الملحي المعقم وضبط التركيز مع وزن الحيوان ومعدل الإنجاز للمضخة. تبقى AngII المعاد تشكيلها في أنابيب بلاستيكية (لا تستخدم أنابيب زجاجية).</li>
	<li>ملء المضخات مع الحل أنجيي تسليم 1 mg/(kg·d) لمدة 7 أيام. بعد الإعداد، إبقاء المضخات في المحلول الملحي المعقم ح 4-6 الحد الأدنى عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>اختبار التخدير الكامل للماوس بعد الحقن بمزيج التخدير مع مؤخرة القدم ردود الفعل ووضعه على ميدان العملية الحارة. تحريض التخدير يأخذ 10-15 دقيقة، ويعمل بشكل أفضل إذا كان يتم وضع الحيوانات في بيئة مظلمة.</li>
	<li>يحلق السفلي الخلفي للماوس وتطهير من ذوي البشرة كحولية مطهر.</li>
	<li>جعل شق 1 سم عمودي على العمود الفقري باستخدام مقص. إنشاء جيب للمضخة باستخدام هيموستات مضيق وإدراج المضخة (تدفق وسيط أولاً). الجيب يجب أن تسمح بحرية حركة المضخة مع لا الضغط على الجرح.</li>
	<li>إغلاق الجرح بخياطة الجروح، ولا من مقاطع، بغية الحد من الالتهاب؛ ثم تطهير مع الجلد مطهر.</li>
	<li>استعداء التخدير بالحقن الليبي من 200 ميليلتر من خليط أنتيسيدان والعودة الماوس إلى قفصة.</li>
	<li>إجراء التسكين بعد العمل الجراحي مع البوبرينورفين (0.075 مغ/كغ الليبي) مرة واحدة بعد الجراحة، والطلب اعتماداً على سلوك الحيوانات.</li>
</ol>
3. زرع القسطرة jugular وإعداد كاروتيدس
<ol>
	<li>اختبار التخدير الكامل للماوس بعد حقن التخدير مزيج مع ردود الفعل الغذاء الخلفي ومع تحقيق المستقيم من أجل الحفاظ على درجة الحرارة ووضع المرهم مكان الحيوان أنيسثيتيزيد في ريكومبينسي الظهرية على لوحة العمليات الجراحية 39 درجة مئوية عيون لحمايتهم أثناء الإجراءات.</li>
	<li>إزالة الشعر الرقبة باستخدام كريم إزالة الشعر. استخدم مسحه القطن إلى انتشار وفرك كريم لمدة 2 دقيقة حتى يبدأ الشعر تسقط. وبعد دقيقتين إضافية، إزالة الشعر وكريم بملعقة وتطهير الجلد مع جلد كحولية مطهر.</li>
	<li>إجراء الجراحة تحت ستيريوميكروسكوبي. جعل شق طويل 1-1.5 سم في الجلد طوليا في الرقبة، 1 سم بجانب القصبة الهوائية. ثم جعل اثنان شقوق أخرى عمودياً إلى كل الأطراف من شقوق الأولى.</li>
	<li>بعناية إزالة الأنسجة المجاورة للجلد وإزالة قطعة الجلد تغطي حبل الوريد الأيسر والقصبة الهوائية.</li>
	<li>عزل بعناية في الغدة النكفية؛ الغدد تحت اللسان وسوبماكسيلاري من منطقة الاهتمام بالملقط منحنى 2. لا قطع أو إتلاف الغدد، وضعها للسماح بوصول أفضل إلى حبل الوريد، وإلى كاروتيدس.</li>
	<li>لعزل حبل الوريد، استخدام الملقط رقيقة وفتح ببطء وإغلاقه لتخليص السفينة من الأنسجة المحيطة بلطف. مرة واحدة الوريد نظيفة تماما، ضع الملقط تحت السفينة ومكان خيوط 7-0 اثنين من 10 سم تحت هو.</li>
	<li>إغلاق خياطة الدانية في الرأس مع عقده اثنين. المعني خياطة الجروح الأخرى، تعد عقده واحدة ولكن لا تغلقه.</li>
	<li>إجراء القسطرة (0.28 ملم داخل القطر، القطر الخارجي مم 0.61) مليئة 37 درجة مئوية المالحة العقيمة مع الملقط يد واحدة؛ بينما باليد الأخرى، إجراء شق صغير في السفينة مع مقصات رقيقة أو إبرة ز 26 منحنية. ثم إدراج القسطرة إلى حبل الوريد وإغلاق العقدة مرتين. إغلاق خياطة الدانية في الرأس خلال القسطرة ضمانا لإكمال التثبيت.</li>
	<li>لعزل وإعداد الشرايين السباتي، تشريح منطقة تغطي القصبة الهوائية باستخدام الملقط منحنية رقيقة.</li>
	<li>بمجرد كاروتيدس خالية من الأنسجة المحيطة، وإزالة العصب المبهم (يبدو وكأنه خط أبيض المتاخمة السباتي) من السفينة (لكن لا قطع عليه). ويمكن إغلاق الملقط رقيقة وفتحت ببطء برفق تعبئة العصب.</li>
	<li>مرة واحدة كل الشرايين نظيفة تماما, ضع الملقط تحت الشريان السباتي الأولى ووضع صغيرة سوداء 3 مم x واسعة 2.5 سم طول بلاستيك قطعة تحت السفينة. من المهم جداً عدم استنفاد الطاقات في السفينة والتأكد من أن تدفق الدم هذا حالما يتم وضع صاحب السفينة. مكان الشريان الثاني أكثر من صاحب السفينة. إذا لم يتم وضع الماوس مباشرة تحت المجهر، وضع مرة أخرى في الغدد عبر القصبة الهوائية وتطبيق المالحة العقيمة 37 درجة مئوية لتجنب تجفيف المنطقة.</li>
</ol>
4-تقييم المتداول والالتزام الكريات البيضاء/ليسم + الخلايا مع ناقلات الأمراض
<ol>
	<li>إعداد أكريديني البرتقالي من حل أسهم 2 مغ/مل المخزنة في-20 درجة مئوية، ويضعف من 1:4 في سالين معقم (0.5 ملغ/مل تركيز النهائية) في حقنه 1 مل.</li></ol>حماية المحاقن من الضوء واستخدم 200 ميليلتر كل واحدة من الماوس.<ol>
		<li>اختبار ظروف مختلفة: (1) حقن أكريديني البرتقالي بالقسطرة جوجولار؛ (2) حقن أكريديني البرتقالي مباشرة في الوريد الذيل الأفقي (مع هذا الشرط كان مزروع لا قسطرة jugular)؛ (3) قياس دون أكريديني البرتقالي استخدام الفلورية ليسمكري++ أسندت الفئران (هنا مرة أخرى تم زرعها لا قسطرة جوجولار).</li>
	</ol>
	
	<li>متى القسطرة في المكان وكاروتيدس اثنين معزولة، ضع الماوس تحت المجهر. إجراء قياسات مجهر عالي السرعة واسع المجال فلورية استخدام مكثف مسافات طويلة، و 10 X (نا 0.3) الماء الغمر الهدف مع مونوتشروماتور والخائن شعاع كاميرا جهاز اقتران. إجراء تحليل لنظام التصوير في الوقت الحقيقي والحصول على الصور.</li>
	<li>وتركز الهدف المجهر في منتصف الشريان السباتي في سطح البطانة. ببطء بحقن 50 ميليلتر من أكريديني البرتقالي (0.5 ملغ/مل) (تأخذ في الاعتبار حجم قتيلا القسطرة لحقن الأولى). تعيين البرنامج لتسجيل الصور 100 مع وقت تعرض من 120 ميلي ثانية كل صورة.</li>
	<li>جعل أشرطة الفيديو أربعة في الشريان السباتي (اليمين واليسار) في مواقع مختلفة في الشريان لكل فيديو. إذا انخفضت إشارة الأسفار، حقن ميليلتر 50 آخر من أكريديني البرتقالي.</li>
	<li>بعد تسجيل جميع أشرطة الفيديو euthanize الحيوان بخلع عنق الرحم.</li>
	<li>تعيين سرعة الفيديو في 10 صور في الثانية الواحدة والتحديد الكمي للخلايا المتداول وملتصقة في طريقة عرض مستطيل µm 200 ميكرومتر x 250 وضعت في وسط السفينة لكل فيديو. حساب عدد الخلايا المتجددة وملتصقة؛ يتم تعريف الخلايا ملتصقة كالخلايا التي لا تتحرك أو فصل من البطانة داخل الفيديو s 10. لتبسيط عملية القياس الكمي، إزالة القناة مع الأسفار الحمراء واستخدم فقط في الفلورية الخضراء لعد الخلايا المتداول والمنضمة إليها.</li>
	<li>لتجارب باستخدام أكريديني البرتقالي، جعل عتبة يدوي للأسفار من أجل إزالة الخلفية بواسطة خلايا بطانية.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

وعرضت وحيدات+ سابقا أنه متورط في تطوير ارتفاع ضغط الدم5. هنا نظهر أن الخلايا المناعية+ رول والتمسك بالطبقة غشائي ردا على ضخ أنجي. تم الحصول على هذه النتيجة باستخدام ليسمكري++ أسندت الفئران من دراساتنا السابقة استكشاف دور الخلايا المناعية في ارتفاع ضغط الدم في فيفو بتصور الكريات البيضاء مع حقن أكريديني البرتقالي6،10. وهكذا، لم يكن من الممكن تمييز أنواع الخلايا التمسك بالبطانة.
ناقلات الأمراض أداة مفيدة جداً للدراسات والأوعية الدموية و في فيفو ملاحظات الخلايا مباشرة في المفرج، ولكن ما زال أثر حقن الأصباغ مع المساعدة من قسطرة جراحيا المدرجة في سياق التحريضية لارتفاع ضغط الدم غير معروف. لتقييم الأثر المحتمل للقسطرة وأكريديني البرتقالي حقن أخذنا استفادة ليسمكري+الفئران سيبحث+ . ضخ أنجيي زاد العدد المتداول الخلايا+ للبطانة. إدخال قسطرة في الوريد تضخيم التأثير والكريات البيضاء أكثر المتداول والمنضمة إليها، تم الكشف عن الفئران التي غرست AngII تجهيزها قسطرة مقارنة بالفئران دون زرع القسطرة. يشير هذا إلى أن غرس أسباب القسطرة السباتي فعل التهابات الجهازية في السياق التئام ذلك التراكبات مع رد فعل المناعة في18من ارتفاع ضغط الدم. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً للقرب من حبل الوريد إلى الشريان السباتي تنشيط المناعي إضافية ربما يكون قد حدث يؤثر على حبل الوريد. أن هذا التأثير لم يكن حاضرا عندما قدمت حقن الوريد الذيل مباشرة، يمكننا أن نفترض أن التأثير كان من المقرر إلا الصبغة أن الإجراء من إدخال القسطرة. ونحن هنا أثبتت أهمية الفئران المعدلة وراثيا مراسل معربا عن البروتينات الفلورية لا تتداخل مع عمليات في فيفو أثناء التجريب. وعلاوة على ذلك، قد يكون حقن الوريد الذيل من تتبع الفلورسنت بديلاً ممكناً لحقن القسطرة jugular.
خطوة حاسمة واحدة من هذا الإجراء هو ضخ أنجي. يمكن إجراء تقييم الكفة الذيل من ضغط الدم بغية التحكم في فعالية تقديم AngII بالمضخة. وينبغي زيادة ضغط الدم بعد أيام 2−3 للتسريب. للحد من الالتهابات التي يمكن أن تؤثر في تنشيط الخلايا+ ، ينبغي إغلاق شق حيث يتم زرع المضخة بخياطة الجروح بدلاً من القصاصات. يجب الإشارة إلى حد واحد عن حقن الوريد الذيل: جعل اقتناء البيانات الممكنة أفضل 4 أشرطة الفيديو تتخذ عادة لكل السباتي. إذا انخفضت إشارة الفلورسنت، يتم حقن 50 ميليلتر من أورانج أكريديني لكن مع حقن ذيل أنها أكثر صعوبة لجعل الحقن عدة وللحفاظ كاروتيدس مستقرة تحت المجهر والهدف. قد تعدل مدة وجود قسطرة في حبل الوريد أيضا تنشيط الخلايا المناعية نظراً لأنها تؤثر على تفعيل تخثر الدم في البلازما الغنية بالصفائح الدموية المعدة ح 4 بعد زرع القسطرة19. هذا الجانب من زرع قسطرة يحتاج إلى مزيد من التحقيق.
أخيرا، حتى لو أننا نقدر أثر زرع القسطرة جوجولار على+ خلية التنشيط بعد ضخ أنجي، نحن لا تماما تقدير دور إعداد وإزالة الجلد، وعزل السباتي في خلية+ المحتملة التنشيط. نخلص إلى أن استخدام الفئران مراسل الأسفار مثل ليسمكري++ أسندت يوصي بالماوس لتفادي الإخلال بسلامة السفينة أثناء إعداد الحيوانات للتصوير في فيفو .

ارتفاع ضغط الدم الشرياني يزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والموت، ويعزز التنمية لتصلّب الشرايين، وأمراض القلب والشرايين، وثرومبومبوليسمس الشرياني أو الوريدي1. تطوير ارتفاع ضغط الدم يعتمد على التفاعل بين العوامل البيئية والوراثية والغدد الصماء والفسيولوجية. حاليا، تقدر الحصانة والتهاب ذات الصلة أن تلعب دوراً هاما في مسببات ارتفاع ضغط الدم2.
بين الخلايا المناعية، وجد أن أن تشارك سببياً في التهاب الأوعية الدموية الناجمة عن أنجي وارتفاع ضغط الدم، في الجزء المتصلة بقدرتهم على تحريك أنواع الأكسجين التفاعلية3لمفاوية T، فضلا عن وحيدات والضامة. بلعم محفزة لمستعمرة عامل ناقص الفئران أظهرت انخفاض ردا على أنجي فيما يتعلق بزيادة ضغط الدم والتهاب الأوعية الدموية4. في أعمال سابقة، يمكن أن نظهر أن محرك ليسم + وحيدات الخلل في الأوعية الدموية والتهاب في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن أنجي5. في الآونة الأخيرة، وصفت لنا طريقا رواية التي تخثر العامل الحادي عشر تتعاون مع الصفائح الدموية وجدار الوعاء للحث على التهاب الأوعية الدموية ثرومبين-تعتمد على6. كان مؤخرا تلخيص المعارف الحالية حول دور الجهاز المناعي في ارتفاع ضغط الدم واستعرضها رودريغيز-ايتوربيه وآخرون. 7
وبالمشاركة الخلايا المناعية في تطوير ارتفاع ضغط الدم أصبح واضحا، أصبح من الضروري نماذج وتقنيات لدراسة التفاعل بين السفينة والخلايا المناعية. ابيفلوريسسينسي ناقلات الأمراض الأوعية الدموية أداة مفيدة لمراقبة في فيفو التفاعلات بين تعميم خلايا الدم و البطانة8،،من910. مع هذه التقنية، يمكن تصور حقن الأصباغ إينتيركالاتينج مع الحمض النووي (مثل البرتقال أكريديني) الخلايا المنواه (المتداولة، وكذلك من البطانة). الصفائح الدموية المعزولة الملون السابقين فيفو مع رهودامين-6 ز أو يمكن حقن ديتشلوروفلوريسسين (DCF) لتصور خثرة الغنية بالصفائح الدموية في نماذج الإصابة الشريانية أو الوريدية.
عادة، تستخدم لحقن مواد استشفاف قسطرة الوريد أو وضع علامة على الصفائح الدموية. تغيير البطانة والتنشيط اللاحقة من تتالي تخثر الدم سواء معروفة آثاراً على تفعيل الوحيدات. إصابة غشائي فورا يؤدي إلى تنشيط الصفائح الدموية عن طريق الجزيئات مصفوفة سوبيندوثيليال لختم الأنسجة، التي تلت ذلك الجذب والتنشيط الوحيدات11. على العكس من ذلك، المعروف بطانة سليمة خصائص التخثر (مثلاً، عن طريق الأنسجة عامل مثبط مسار أو ثرومبومودولين)12 والآثار المثبطة المباشرة على الوحيدات، مثلاً، عن طريق إفراز حويصلات خارج الخلية التي تحتوي على ميكرورناس13. وحيدات معروفة لإنتاج عامل نسيج، المنشط الخارجية تتالي التخثر والتعبير عن مستقبلات حوزتي المنشط (بارس) أن المشاركة في الوحيدات التنشيط14،15 ويمكن تنشيطه بواسطة ثرومبين . ولذلك، أي تنشيط الصفائح الدموية أو تتالي تخثر الدم نتيجة إصابة الأوعية الدموية قد آثار غير متوقعة على تفعيل الوحيدات وتتداخل مع هذه الظاهرة الملحوظة. مع المساعدة من أسندت المعدلة وراثيا Cre ليسم الفئران المعدلة وراثيا، ماوس مراسل Cre الفلورسنت مزدوجة (ليسمكري+أسندت+)، نقترح دراسة تأثير الحقن بالتفصيل مع أساليب القسطرة والبديل في+ حيدي الخلايا الموجودة في نموذج الفأر من ارتفاع ضغط الدم الشرياني16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

ابيفلوريسسينسي المجهري الفيديو إينترافيتال (ناقلات) الأوعية الدموية أسلوب المتبعة لتقييم تفعيل الخلايا المناعية وقدرتهم على الدور والالتزام بالطبقة غشائي. ويشيع استخدام التصور لتعميم خلايا بحقن الأصباغ الفلورية أو الأجسام المضادة إلى جانب فلوروفوري. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الفئران مراسل الفلورسنت. التفاعلات بين الكريات البيضاء، بخاصة ليسوزيمي م+ (+) وحيدات، مع جدار الوعاء دوراً محوريا في تعزيز الخلل في الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم الشرياني. نقدم هنا هذه التقنية لتصور وتحديد كمية الكريات البيض المتداول والالتصاق في الشرايين السباتي في انجيوتنسين الثاني (أنجي)-التي يسببها ارتفاع ضغط الدم في الفئران من ناقلات الأمراض.
زرع قسطرة يضر جدار الأوعية الدموية، ويؤدي إلى استجابات تغيير خلايا الدم. نحن مقارنة تقنيات الحقن المختلفة وطرق الإدارة لتصور الكريات البيضاء في ليسمكري++ أسندت الماوس مع التعبير على نطاق واسع من البروتين الأحمر نيون والتعبير الشرطي من البروتينات الفلورية الخضراء في ليسم + الخلايا. لدراسة+ خلية التنشيط، استخدمنا AngII غرست الفئران فيها المتداول والتصاق الكريات البيضاء إلى البطانة هو زيادة. نحن أما حقن أكريديني البرتقالي باستخدام حبل القسطرة أو مباشرة على الرغم من الذيل الوريد ومقارنة الكمية المتداول والتقيد بالخلايا. وجدنا أن زرع القسطرة جوجولار في حد ذاتها إلى زيادة عدد المتداول والمنضمة إليها الخلايا+ في الشام غرست ليسمكري+الفئران سيبحث+ بالمقارنة مع عناصر التحكم. تمت زيادة هذا التنشيط في الفئران التي غرست أنجيي. من المثير للاهتمام، التصاق الخلايا أكريديني البرتقالي مباشرة عن طريق الذيل المنطلق لا تزيد+ بالحقن أو المتداول في الفئران التي غرست الشام. وبالتالي نحن أثبتت أهمية الفئران المعدلة وراثيا مراسل معربا عن البروتينات الفلورية لا تتداخل مع عمليات في فيفو أثناء التجريب. وعلاوة على ذلك، قد يكون حقن الوريد الذيل من تتبع الفلورسنت بديلاً ممكناً لحقن القسطرة jugular.

كاروتيدس من ليسمكري++ أسندت لوحظت الفئران يملؤه AngII استخدام ناقلات الأمراض. تم حقن أورانج أكريديني باستخدام قسطرة جوجولار. نحن يهدف إلى إلقاء نظرة على نسبة الخلايا+ على اتصال بجدار الأوعية الدموية مقارنة بجميع الخلايا يتناقل الأنوية (والتي يمكن أن تتفاعل أيضا مع السفينة نظراً للتمييز في الخلية نوع التفاعل مع السفينة ظلت مفتوحة السؤال من أعمالنا السابقة). في الأساس، ويؤدي وجود قسطرة jugular التصاق الخلايا+ (الشكل 2 أ، د). بعد حقن أكريديني البرتقالي، نفس الخلايا الفلورسنت ولكن أيضا خلايا بطانية الفلورسنت (الشكل 2، ه). بعد الحد الخلفية للحد من غشائي المتعلقة بالأسفار، تشير البيانات إلى أن كافة الخلايا المنواه المنضمة هي+ (الشكل 2، F)؛ تصح هذه النتائج بعد ضخ AngII تؤكد نتائجنا السابقة، ومما يدل على أن ليسمكري++ سيبحث نموذج جيد لمراقبة تأثير أنجيي على+ خلية التنشيط.
نحن تقييم دور إدارة الطرق أكريديني البرتقالي في+ خلية التنشيط بعد ضخ أنجيي في ليسمكري++سيبحث. وبعد أسبوع واحد من ضخ AngII، التفاعلات البطانة الكريات البيض في الشرايين السباتي من ليسمكري++ أسندت الفئران تم تصويرها وتصور بناقلات الأمراض مع أو بدون حقن أكريديني البرتقالي عن طريق قسطرة جوجولار أو عن طريق الوريد الذيل. دون أي القسطرة أو الحقن، المتداول من الخلايا+ تمت زيادة كبيرة بعد ضخ AngII مقارنة بالفئران غير المعالجة، والالتصاق وأظهرت زيادة (الشكل 3). حقن أكريديني البرتقالي قسطرة jugular زيادة التصاق والمتداول في أنجيي معاملة الفئران بدرجة أكبر بالمقارنة مع الفئران دون قسطرة (الشكل 3). حقن أكريديني البرتقالي في هذا السياق الذيل يؤدي إلى التصاق مماثلة والمتداول بالمقارنة مع الفئران التي لم تتلق حقن أكريديني البرتقالي (الشكل 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
الشكل 1. نظام لضخ الثاني انجيوتنسين وتقييم+ الخلايا المتداول والالتصاق في الفئران. ليسمكري++ أسندت الفئران كانت يملؤه 7 أيام أنجي والالتزام، فضلا عن المتداول+ الخلايا على كاروتيدس كانت كمياً مع أو بدون حقن أكريديني البرتقالي من خلال قسطرة جوجولار أو عن طريق الوريد الذيل حقن. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
الرقم 2. تقييم التصاق الخلايا+ والمتداول في الشرايين السباتي من ليسمكري++ أسندت الفئران. خلايا "التصاق ليسم"+ في ليسمكري+الفئران سيبحث+ (أ، د) قبل وبعد الحقن أكريديني (ب، ه) عن طريق قسطرة جوجولار. سجلت الأسفار الحمراء والخضراء، والخلايا+ (باللون الأخضر) وخلايا العضلات الملساء (باللون الأحمر) كانت واضحة. بعد حقن أورانج أكريديني، خلايا بطانية مرئية أيضا باللون الأخضر ولكن إزالة الخلفية الفلورية يسمح فقط بتعميم المنبسطة التصور الخلية (ج، و). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
الشكل 3. تقييم طرق الإدارة من الأصباغ الفلورية في انجيوتنسين الثاني غرست ليسمكري+الفئران سيبحث+ . التحديد الكمي للمتداول (A) والالتزام (ب)+ الخلايا في الشام تعمل أو الحيوانات التي غرست أنجي ومع أو بدون حقن أورانج أكريديني باستخدام قسطرة جوجولار أو عن طريق حقن الوريد الذيل. صور الممثل لظروف مختلفة (ج). النتائج هي ± يعني الخطأ المعياري للوسط. أنجز ANOVA ثنائي الاتجاه و وظيفة المخصص الاختبار بونفيروني، ن = 3-12/المجموعات؛ ف &#60; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

هذه المخطوطة يصف استخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل وطرق الإدارة المختلفة من الأصباغ الفلورية في انجيوتنسين الثاني-فرط ضغط الدم المحرض باستخدام مجهر الفيديو إينترافيتال من الأوعية الدموية لتقييم تفعيل الخلايا المناعية وبهم القدرة على دحر والتمسك بالبطانة.

تصور المتداول الكريات البيض والالتصاق في الفئران التي غرست الثاني انجيوتنسين: تقنيات والمزالق

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

الكشف عن خلايا الدم البيضاء الإنسان مستضد المؤشرات الحيوية في سرطان الثدي الاستفادة تسمية خالية جهاز الاستشعار البيولوجي تقنية

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...