Name: visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

이 작품은 교육과 연구 (BMBF 01EO1003 및 BMBF 01EO1503)에 대 한 독일 정부에 의해 지원 되었다.

실험은 남성 쥐 나이에 라인 지방 팔 라틴 (승인 번호 23 177-07/G12-1-002 및 23 177-07/G15-1-051)에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인 아래 오래 된 8 ~ 12 주에 실시 했다.
1. 마우스 마 취 및 수술 준비
<ol>
	<li>수술 전에 좋은 건강 및 동물의 상태를 확인 합니다. 수술 전에 체중, 음식, 및 물 소비 (모양, 자세, 자연 스러운 행동) 그들의 일반적인 조건에 대 한 2-3 일 동안 하루에 한 번씩 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>준비 마스터 믹스 midazolam (5 mg/kg 체중), medetomidine (0.5 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 몸 무게)와 마 취에 대 한 intraperitoneally (i.p.) 26 G 바늘 200 µ L/30 g 마우스 1 mL 주사기에 주입.</li>
	<li>삼 투 펌프 주입 및 IVM 실험 동물 준비 플랫폼 온난화 39 ° c는 작업 필드에 수행 됩니다. 소독 목욕에 모든 도구를 소독 하 고 소독 온난화 플랫폼.</li>
	<li>절차 동안 눈 연 고와 동물 눈을 보호 합니다. 삼 투 펌프 주입 전에 면도기와 모피를 제거 합니다. 제 모 크림, 면봉을 사용 하 여 년 및 jugular 카 테 테 르 주입 IVM 실험에서의 격리에 대 한. 2 피부 소독 제를 사용 하 여 동물의 피부를 소독: 한 살 균 및 살 균 제 povidone 요오드와 한을 포함 하 피부 살 균 포함 octenidine 알코올 기반 솔루션.</li>
	<li>반대 flumazenil (0.01 mg/kgbody 중량), atipamezol (0.05 mg/kg 체중)와 마 취 ("antisedan") 믹스 마스터 믹스를 준비 하 고 피하 것 26 G 바늘 200 µ L/마우스 1 mL 주사기에 준비 (사우스 캐롤라이나) 주입.</li>
</ol>
2. 삼 투 펌프 준비 및 이식
참고: 삼 투 펌프를 사용 하 여 피하 AngII 주입 Lu 그 외 여러분 에 의해 상세히에서 기술 되었다 17
<ol>
	<li>멸 균 식 염 수와 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여는 AngII를 준비 하 고 농도 동물 무게와 펌프의 배달 속도 조정. 플라스틱 튜브 (유리 튜브를 사용 하지 마십시오.)에서 재구성 된 AngII를 유지.</li>
	<li>7 일 동안 1 mg/(kg·d)를 제공 하는 AngII 솔루션으로 펌프를 채우십시오. 준비 후에, 펌프에서에서 계속 4-6 h에 대 한 살 균 염 분 최소 37 ° c.</li>
	<li>후면 마 취 혼합의 사출 반사 발 고 따뜻한 작업 필드에는 마우스의 완벽 한 마 취를 테스트 합니다. 마 취 유도 10-15 분 소요 하 고 동물 어두운 환경에서 배치 하는 경우 더 잘 작동 합니다.</li>
	<li>마우스 뒷면 하단을 면도 하 고 알콜 피부 살 균 소독.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 척추에 수직인 1 cm 절 개를 확인 합니다. 해협 hemostat를 사용 하 여 펌프에 대 한 주머니를 만들고 펌프를 삽입 (먼저 사회자 흐름). 주머니 없는 압력 상처에 펌프의 자유 운동을 허용 해야 합니다.</li>
	<li>염증; 제한 하기 위하여 하지 클립, 봉합와 상처를 닫습니다 그런 다음 피부 살 균 소독.</li>
	<li>Antisedan 믹스의 200 µ L의 사우스 캐롤라이나 주사로 마 취를 반대 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.</li>
	<li>수술 후 진통 buprenorphine와 수행 (0.075 m g/k g 사우스 캐롤라이나) 한 번 수술 후 및 동물의 행동에 따라 수요에.</li>
</ol>
3. jugular 카 테 테 르 주입 및 년 준비
<ol>
	<li>마우스의 완벽 한 마 취 주입 마 취의 후면 음식 반사와 혼합 하 고 온도 유지 하 고 연 고를 두고 직장 프로브와 39 ° C에 수술 등 recumbence에서 마 취 동물을 배치 후 테스트 절차 동안 그들을 보호 하기 위해 눈입니다.</li>
	<li>제 모 크림을 사용 하 여 목 머리카락을 제거 합니다. 면봉을 사용 하 여 확산 하 고 머리카락 밖으로을 시작 될 때까지 2 분 동안 크림을 문 지 르 세요. 추가 2 분 후 주걱으로 크림과 머리카락을 제거 하 고 알콜 피부 살 균으로 피부를 소독 합니다.</li>
	<li>아래는 stereomicroscope 수술을 수행 합니다. 경도 목, 기관지 옆 1 cm에서 피부에 1-1.5 cm 긴 절 개를 확인 합니다. 첫 번째 절 두 사지에 수직으로 다른 두 절을 확인 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 피부 옆 조직 제거 하 고 피부 왼쪽된 경 정 맥 및 기도의 조각을 제거.</li>
	<li>조심 스럽게 분리 귀 밑 샘; 2 곡선된 겸 자에 대 한 관심의 영역에서 설 하 고 submaxillary 땀 샘. 하지 절단 또는 동맥 손상, 경 정 맥에는 년 최고의 액세스할 수 있도록 그들 장소.</li>
	<li>경 정 맥을, 얇은 집게를 사용 하 고 천천히 열고 주변 조직에서 혈관을 부드럽게 닫습니다. 일단 정 맥이 완전히 깨끗 한는 겸 그릇 아래 놓고 아래 각 10 cm의 2 개의 7-0 봉합을 배치.</li>
	<li>두 개의 매듭을 가진 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 다른 봉합에 한 매듭을 준비 하지만 그것을 닫지 마십시오.</li>
	<li>잡고 한 손으로 집게와 37 ° C 살 균 염 분 가득한 테 (안쪽 직경, 0.61 m m 외부 직경 0.28 m m) 다른 한편으로는, 함께 하는 동안 얇은 위 또는 곡선된 26 G 바늘 그릇에 작은 절 개를 확인 합니다. 그런 다음 경 정 맥에 카 테 터를 삽입 하 고 두 번 매듭을 닫습니다. 완전 한 동원 정지를 위해 카 테 터를 통해 머리에 인접 봉합을 닫습니다.</li>
	<li>격리 하 고 경 동맥을 준비, 얇은 곡선된 겸 자 사용 하 여 기관지를 덮고 영역 해 부.</li>
	<li>일단 고 년 조직 주변에서 자유롭다, 선박에서 미주 신경 (흰색 라인은 경 동맥에 인접 한 모양)를 제거 (하지만 그것을 잘라 하지 않습니다). 얇은 포 셉 폐쇄 하 고 천천히 부드럽게 신경을 동원을 열 수 있습니다.</li>
	<li>두 동맥은 완전히 깨끗 한, 일단 아래 첫 번째 경 동맥 겸 자 놓고 작은 블랙 3 m m x 폭 2.5 c m 길이 플라스틱 조각 그릇 아래에 배치 합니다. 그것은 매우 중요 한 선박을 overstretch 하지 고 혈액의 흐름은 선박 소유자 배치 되 면 존재 확인. 두 번째 동맥 선박 소유자를 놓습니다. 마우스는 현미경의 밑에 직접 배치 되지 않습니다, 기도에 땀 샘을 다시 넣어 고 37 ° C 살 균 염 분 지 대의 건조 방지를 적용.</li>
</ol>
4. 압 연 및 백혈구 준수 평가 / LysM + IVM와 세포
<ol>
	<li>-20 ° C에 저장 하는 2 mg/mL 재고 솔루션에서 오렌지 acridine 준비 하 고 그것에 게 1:4 1 mL 주사기에 멸 균 식 염 수 (최종 농도 0.5 mg/mL)에 희석.</li></ol>빛에서 주사기를 보호 하 고 하나의 마우스 당 200 µ L를 사용 하 여.<ol>
		<li>다른 조건을 테스트: acridine jugular 테;와 오렌지의 (1) 주입 (2) 주입 acridine 오렌지 직접 꼬리 옆 정 맥 (이 조건으로 아무 jugular 테 이식 했다); (3) 측정 acridine 오렌지 형광 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 마우스 (여기 다시 아무 jugular 테 이식 했다) 없이.</li>
	</ol>
	
	<li>일단 테 장소 이며 2 년은, 현미경 마우스를 놓습니다. 장거리 콘덴서와 X 10을 사용 하 여 고속 넓은 필드 형광 현미경으로 측정을 수행 (NA 0.3)는 단색, 빔 스플리터와 전 하 결합 소자 카메라 물 침수 목표. 이미지 수집 및 실시간 이미징 시스템 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>경 동맥 내 피 표면에 중간 현미경 목표 초점. 천천히 주사 50 µ L의 acridine 오렌지 (0.5 mg/mL) (고려 첫 번째 주입을 위해 카 테 터의 죽은 볼륨). 이미지 당 120 밀리초의 노출 시간 100 이미지 기록 소프트웨어를 설정 합니다.</li>
	<li>각 비디오에 대 한 동맥에 다른 위치에서 경 동맥 (왼쪽 및 오른쪽) 당 4 개의 동영상을 확인 합니다. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 또 다른 50 µ L을 주입.</li>
	<li>모든 동영상을 녹화 후 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.</li>
	<li>초당 10 이미지 비디오 속도 설정 하 고 각 비디오에 대 한 선박 중앙 배치 200 µ m x 250 µ m 사각형 보기에서 롤링 및 부착 세포 계량. 롤링 및 부착 셀; 부착 세포 이동 하지 않거나 10 s 비디오 내 피에서 분리 된 셀으로 정의 됩니다. 정량화를 단순화 하기 위해 빨간 형광으로 채널을 제거 하 고 롤링 및 접착 셀만 녹색 형광을 사용 합니다.</li>
	<li>실험 acridine 오렌지를 사용 하 여, 내 피 세포에 의해 만들어진 배경을 제거 하기 위해 형광의 수동 임계값을 확인 합니다.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. 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저자 공개할 게 없다

LysM+ monocytes 이전 고혈압5의 개발에 연루를 표시 했다. 여기 우리가 LysM+ 면역 세포 롤 및 내 피 레이어 AngII 주입에 대 한 응답에서을 보여줍니다. 이 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 얻은 acridine 오렌지6,10의 주입으로 백혈구를 시각화 하 여 비보에 고혈압에 면역 세포의 역할을 탐구 하는 우리의 이전 연구에서 생쥐. 따라서, 준수 하는 내 피 세포 유형의 차별 수 없었습니다.
IVM 혈관 연구 그리고 vivo에서 , 맥 관 구조에 직접 셀의 관찰에 대 한 매우 유용한 도구입니다 하지만 고혈압의 염증 성 맥락에서 수술로 삽입 된 카 테 터의 도움으로 염료를 주입의 영향 알 수 없는 남아 있습니다. 카 테 터와 acridine 오렌지의 잠재적 효과 평가 하기 위해 주입 우리 이용 했다 LysMCre++ IRG 쥐. AngII 주입 증가 수 있는 피에 LysM+ 세포의. 경 정 맥에 카 테 터의 삽입 효과 증폭 하 고 더 롤링 하 고 붙는 백혈구 테 임 플 란 트 없이 마우스에 비해 카 테 터와 기구 AngII-주입 마우스에서 발견 되었습니다. 이 이식 조직의 염증 반응의 맥락에서 상처 고혈압18에서 면역 반응으로 오버레이 치유 경 카 테 터 원인의 나타냅니다. 또한, 경 동맥을 경 정 맥의 근접 때문 추가 면역 활성화 수 생겼다 경 정 맥에 영향을 미치는 여. 이 효과 없는 꼬리 정 맥에 직접 주사 되었다 때, 이후 우리 효과 예정 이었습니다 추측할 수 있는 염료에 아닙니다 그러나 카 테 터를 삽입 하는 절차. 우리 여기 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.
절차의 하나의 중요 한 단계는 AngII 주입 이다. 혈압의 꼬리 팔목 평가 펌프 AngII 전달의 효과 제어 하기 위해 만들 수 있습니다. 주입의 2−3 일 후 혈압 증가 한다. 제한 하려면 LysM+ 세포 활성화에 영향을 미칠 수 있는 염증, 펌프는 이식 절 개의 폐쇄 클립 대신 봉합 여야 한다. 꼬리 정 맥 주입에 대 한 한 가지 한계를 지적 한다: 각 경 최고의 가능한 데이터 수집을 하려면 4 동영상 촬영 일반적으로. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 50 µ L 주입 하지만 꼬리 주사로 더 어렵습니다 여러 주사는 년 현미경 목표 아래 안정적으로 유지 하 고. 경 정 맥에 카 테 터의 존재의 기간 때문에 혈소판이 풍부한 혈장 카 테 테 르 주입19후 4 h 준비에 응고 활성화에 영향을 미치는 면역 세포 활성화를 조절 또한 수도 있습니다. 카 테 테 르 주입의이 부분 추가 조사가 필요합니다.
마지막으로, 우리가 감사 jugular 카 테 테 르 주입 AngII 주입 후 LysM+ 세포 활성화에 미치는 영향, 경우에 우리 수 없습니다 완전히 견적 준비, 피부 제거, 및 잠재적인 LysM+ 셀에 경 격리의 역할 활성화입니다. 우리는 그 형광 기자 마우스를 사용 하 여 같은 결론 LysMCre++ IRG 마우스 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 동물 준비 중 선박 무결성의 혼란을 피하기 위해 좋습니다.

동맥 고혈압 심혈 관 질환과 죽음의 위험을 증가 하 고 동맥 경화 증, 관상 동맥 심장 병 및 동맥 또는 정 맥 thromboembolisms1의 개발을 촉진. 고혈압의 개발 환경, 유전, 내 분 비과 hemodynamic 요인의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 현재, 면역과 관련 된 염증 고혈압2의 병 인에 중요 한 역할을 감사 합니다.
면역 세포 중 T 림프 톨, monocytes 그리고 대 식 세포는 AngII 유도 혈관 염증과 고혈압, 반응성 산소 종3하 그들의 능력에 관련 부분에 원인이 되 관련 된 것을 발견 했다. 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 결핍 마우스 혈압 증가 및 혈관 염증4AngII 감소 반응을 보였다. 이전 작품에서 우리는 LysM + monocytes 드라이브 AngII 유발 고혈압5에 염증과 혈관 장애는 표시할 수 있습니다. 더 최근에, 우리는 새로운 통로 응고에 요소 사이 협력 혈소판 및 트 롬 빈-종속 혈관 염증6유도 하 혈관 벽 설명. 고혈압에 면역 시스템의 역할에 대 한 현재의 지식은 요약 최근 되었고 로드 리 게 스-Iturbe 외의 검토. 7
때문에 고혈압의 개발에 면역 세포의 관련 되었다 분명, 모델 및 선박 및 면역 세포 간의 상호 작용을 공부 하는 기술을 필요한 되었다. 혈관의 Epifluorescence IVM vivo에서 순환 하는 혈액 세포와 내 피8,,910간의 상호작용을 관찰 하는 유용한 도구입니다. 이 기술로 염료 (acridine orange) 같은 dna intercalating의 주입 nucleated 세포 순환 뿐만 아니라 (endothelium에서)을 시각화할 수 있습니다. Ex vivo rhodamin-6 G와 격리 된 혈소판 스테인드 또는 dichlorofluorescein (DCF) 동맥 또는 정 맥 손상 모델에서 혈소판이 풍부한 혈전을 시각화를 주입 할 수 있습니다.
경 정 맥 카 테 터를 추적기를 삽입 하는 데 사용 하 또는 표시 하는 일반적으로, 혈소판. Endothelium의 변경 및 응고 캐스케이드의 후속 활성화 모두 monocyte 활성화에 효과를 알려져 있습니다. 내 피 부상 즉시 이끌어 낸다 혈소판 활성화 subendothelial 매트릭스 분자를 통해 이어지는 monocyte 매력 및 활성화11조직 인감. 그와 반대로, 그대로 피는 항 응 혈 약 속성 (예를 들어, 직물 요인 통로 억제 물 또는 thrombomodulin)12 과 직접 금지 monocyte, 예를 들면,의 분 비를 통해에 알려져 microRNAs13를 포함 하는 extracellular 소포. Monocytes 조직 요인, 특급 프로 테아 제-활성화 수용 체 (동위) 트 롬 빈에 의해 활성화 될 수 있다 monocyte 활성화14,15에에서 참여 하 고 응고 캐스케이드의 외부 활성 제를 생산 알려져 있습니다. . 따라서, 어떤 활성화 혈소판 또는 응고 캐스케이드 혈관 부상으로 인해 있을 수 있습니다 monocyte 활성화에 대 한 예기치 않은 효과 관찰된 현상 방해. IRG 유전자 변형 LysM Cre 유전자 변형 생쥐, 더블-형광 Cre 기자 마우스 (LysMCre+IRG+)의 도움으로, 우리는 LysM+ 에 카 테 터와 대안 방법으로 주사의 효과 자세히 연구 제안 동맥 고혈압16의 마우스 모델에서 myelomonocytic 셀.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

혈관의 Epifluorescence intravital 비디오 현미경 (IVM) 면역 세포의 활성화 및 역할에 그들의 능력을 평가 하 고 내 피 층에 고착 하는 설정된 방법입니다. 형광 염료의 fluorophore 결합 항 체를 주입 하 여 세포를 순환의 일반적으로 사용 됩니다. 또는, 형광 기자 마우스 사용할 수 있습니다. + (LysM+) 특정 lysozyme M에서에서 백혈구의 상호작용 monocytes, 혈관 벽과 혈관 장애 및 동맥 고혈압에 중추적인 역할. 우리는 여기 시각화 하 고 압 연 하는 백혈구 및 접착 angiotensin II (AngII)에 있는 경 동맥에서 계량 기법 제시-IVM에 의해 쥐에서 고혈압을 유발.
카 테 터의 이식 혈관 벽을 손상 하 고 바꾸 인된 혈액 세포 응답에 연결 됩니다. 우리 다른 주입 기술 및 LysMCre++ IRG에서에서 백혈구를 시각화 하기 위해 관리 경로 비교 붉은 형광 단백질의 광범위 한 표현 및 LysM에 있는 녹색 형광 단백질의 조건식 마우스 + 세포. LysM+ 세포 활성화, 연구를 사용 하는 AngII 마우스 주입 압 연 및 접착 endothelium에 백혈구의 증가. 우리 역시 acridine 오렌지는 경을 사용 하 여 카 테 터를 주입 또는 직접 꼬리 정 맥 하 고 비교의 양을 압 연 및 준수 세포. 우리는 jugular 카 테 테 르 주입 당 회전의 수를 증가에 붙는 LysM+ 세포 가짜 주입 LysMCre++ IRG 마우스 컨트롤에 비해 발견. 이 활성화는 AngII 주입 마우스에서 증강 되었다. 흥미롭게도, acridine 오렌지 직접 꼬리를 통해 정 맥 증가 하지 않았다 LysM+ 세포 접착을 주입 또는 가짜 주입 마우스에서 압 연. 우리는 그로 인하여 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.

년 LysMCre++ IRG의 쥐 AngII 주입 IVM를 사용 하 여 관찰 했다. Acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 주입 했다. 우리가 모든 nucleated 순환 세포 (배와 상호 작용 하는 셀 형식의 차별 남아 오픈 이후 선박 상호 작용 또한 수에 비해 혈관 벽 접촉 LysM+ 세포의 비율을 보면 목적 우리의 이전 작품에서 질문)입니다. 기준선에 jugular 카 테 터의 존재는 LysM+ 세포 (그림 2A, D)의 접착을 발생합니다. 오렌지 acridine 주입 후 동일한 세포 형광, 되었지만 또한 내 피 세포 형광 (그림 2B, E). 내 피를 제한 하려면 배경 감소 관련 형광, 후 데이터 나타냅니다 모든 nucleated 고집 셀 LysM+ (그림 2C, F); 이러한 결과 우리의 이전 결과 확인 하 고 LysMCre++ IRG는 LysM+ 세포 활성화에 AngII의 효과 관찰 하기 좋은 모델을 보여주는 AngII 주입 후 사실 만요.
우리 평가 acridine LysM+ AngII LysMCre++IRG에에서 주입 후 세포 활성화에 오렌지의 관리 노선의 역할. AngII 주입, 백혈구 endothelium 상호 작용의 1 주 후 LysMCre++ IRG의 경 동맥에 마우스 몇 군데 있었고 jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥을 통해 오렌지 acridine 주입 없이 IVM에 의해 시각. 카 테 터 나 주입, 없이 LysM+ 세포의 롤링 크게 증가 되었다 AngII 주입 치료 쥐 및 접착에 비해 증가 (그림 3)를 보여준 후. Acridine jugular 테 증가 접착 및 AngII에서 오렌지의 주사 카 테 터 (그림 3) 없이 쥐와 비교 된 더 큰 정도로 쥐 취급. 과 비슷한 접착 acridine 꼬리 정 맥에 주황색의 사출 리드 acridine 오렌지 (그림 3)의 주입에는 영향을 받지 않은 쥐에 비해 압 연.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
그림 1입니다. Angiotensin II 주입 및 LysM+ 의 평가 제도 압 연 및 쥐에 접착 세포. LysMCre++ IRG 마우스 AngII 7 일 주입 했다 하 고는 년 동안 셀 acridine jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥에 의해 오렌지의 주입 없이 계량 했다 준수로 LysM+ 압 연 사출입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
그림 2입니다. LysM+ 세포 접착 및 IRG+ 마우스 LysMCre+의 경 동맥에서 압 연의 평가. 접착의 LysM+ LysMCre+(A, D) 전에 IRG+ 마우스 세포 (B, E) acridine 주입 jugular 카 테 터를 통해 후. 빨간색과 녹색 형광 기록 했다, (녹색)에서 LysM+ 세포 및 평활 근 세포 (빨간색)으로 표시 했다. Acridine 오렌지의 주입, 후 내 피 세포도 그린에서 볼 수 있지만 셀 시각화 (C, F) nucleated만 순환 수 배경 형광을 제거. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
그림 3입니다. Angiotensin II에에서 형광 염료의 관리 노선 평가 LysMCre+IRG+ 쥐를 주입. 압 연 (A)와 (B) LysM+ 준수의 정량화 세포 가짜 운영 또는 AngII 생긴 동물 및 또는 없이 acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 또는 꼬리 정 맥 주입 하 여 주입. 다른 조건 (C)의 대표 사진. 결과 평균 ± 표준 오차의 의미. 2-방법은 ANOVA 수행한 Bonferroni의 임시 게시물 테스트, n = 3-12/그룹; p &#60; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

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During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...