Name: visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

Bu eser eğitim ve araştırma (BMBF 01EO1003 ve BMBF 01EO1503) için Almanca bakanlık tarafından desteklenmiştir.

Deneyler erkek fareler yaş 8-12 hafta yaşlı hayvan deney Rheinland-Pfalz (yetki numarası 23 177-07/G12-1-002 ve 23 177-07/G15-1-051) üzerinden etik komitesinde onayı altında yapılmıştır.
1. anestezi ve ameliyat hazırlığı fare
<ol>
	<li>Ameliyat öncesi, iyi sağlık ve hayvanların durumunu doğrulayın. Ameliyattan önce vücut ağırlığı, gıda ve su tüketimi yanı sıra hayvanlar genel durumlarını (görünüm, duruş, kendiliğinden davranış) 2-3 gün için günde bir kez izlemek.</li>
	<li>Ana mix anestezi midazolam (5 mg/kg vücut ağırlığı), medetomidine (0.5 mg/kg vücut ağırlığı) ve fentanil (0,05 mg/kg vücut ağırlığı) için intraperitoneally hazırlamak (IP) 1 mL şırınga 200 µL/30 g fare bir 26 G iğneyle enjekte.</li>
	<li>Ozmotik pompa implantasyon ve hayvan hazırlık IVM deneyler için bir çalışma alanı platformu ısınma 39 ° C ile gerçekleştirilir. Bir dezenfeksiyon banyoda tüm araçları sterilize ve dezenfekte ısınma platformu.</li>
	<li>İşlemler sırasında göz merhem ile hayvan gözleri koruyun. Kürk ozmotik pompa İmplantasyondan önce jilet ile kaldırın. Şahdamarı ve Şah kateter implantasyon IVM deneylerde yalıtım için krem epilasyon ve pamuk temizleme bezi kullanın. Hayvan deri iki cilt Dezenfektanlar kullanarak dezenfekte: dezenfektan povidone iyot ve bir içeren ve bir antiseptik cilt çözümde alkol bazlı antiseptik içeren octenidine.</li>
	<li>Anestezi ("antisedan mix") atipamezol (0,05 mg/kg vücut ağırlığı) ve flumazenil (0.01 mg/kgbody ağırlık) ile kışkırtmak için ana karışımını ve subkutan olmak 26 G iğne ile 1 mL şırınga 200 µL/fare hazırlayın (SC) enjekte.</li>
</ol>
2. ozmotik pompa hazırlık ve implantasyon
Not: ozmotik pompaları kullanarak subkutan AngII infüzyon Lu vd tarafından ayrıntılı olarak açıklanan yapıldı. 17
<ol>
	<li>AngII steril serum fizyolojik ile lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlamak ve konsantrasyon ile hayvan ağırlık ve pompa teslim edilme oranını ayarlamak. Sulandırılan AngII (cam tüpler kullanmayın) plastik tüplerde tutun.</li>
	<li>Pompalar 1 mg/(kg·d) 7 gün boyunca teslim için AngII solüsyonu ile doldurun. Sonra hazırlık, pompalar için 4-6 h steril serum fizyolojik 37 ° C'de en az tutun</li>
	<li>Enjeksiyon arka ile anestezi karışımı refleksleri ayak ve sıcak işlem sahaya yerleştirin sonra fare tam anestezi sınayın. Anestezi indüksiyon 10-15 dakika sürer ve karanlık bir ortamda hayvanlar girdiyseniz daha iyi çalışır.</li>
	<li>Fare arka alt tıraş ve alkollü bir cilt antiseptik ile dezenfekte.</li>
	<li>1 cm kesi makas kullanarak omurga dik olun. Boğaz bir hemostat kullanarak pompa için bir cep oluşturmak ve pompa eklemek (moderatör ilk Debi). Cep yaranın üzerine baskı ile pompa, serbest dolaşımına izin vermesi gerekir.</li>
	<li>Dikişler ve kliplerini değil, yarayla iltihap sınırlamak için kapatır; sonra cilt antiseptik ile dezenfekte edin.</li>
	<li>Anestezi antisedan Mix 200 µL SC enjeksiyon tarafından düşman ve fareyi onun kafes için dönün.</li>
	<li>Buprenorfin ile ameliyat sonrası analjezi yürütmek (0.075 mg/kg SC) ameliyattan sonra ve isteğe bağlı olarak hayvan davranışları bağlı bir kez.</li>
</ol>
3. Şah kateter implantasyon ve şahdamarı hazırlık
<ol>
	<li>Anestezi enjeksiyonu ile arka gıda refleksleri karıştırın ve sıcaklık ve merhem koymak için bir rektal sonda ile 39 ° C cerrahi plaka üzerinde dorsal recumbence imzalat hayvan yer sonra fare tam anestezi sınayın işlem sırasında onları korumak için gözler.</li>
	<li>Boyun tüyleri saç dökücü krem kullanarak. Bir pamuklu çubukla yaymak ve tüyleri dökülmeye başlayana kadar 2 min için Krem ovmak için kullanın. Bir ek 2 dakika sonra krem ve kıllar bir spatula ile kaldırın ve deriyi alkollü bir cilt antiseptik ile dezenfekte.</li>
	<li>Bir stereomicroscope altında ameliyat. 1-1.5 cm uzun kesi boyun, Trakea yanında 1 cm boyuna deride olun. Sonra ilk insizyon her iki ekstremite için dik iki kesik yapın.</li>
	<li>Dikkatle doku cilt yanında kaldırmak ve sol juguler ven ve nefes borusunu kaplayan deri parçası kaldırın.</li>
	<li>Dikkatle parotid bezi izole; dil ve submaxillary bezleri bölgesinden 2 eğri Forseps ile ilgi. Değil kesmek ya da bezleri zarar, yer onları juguler ven ve de en iyi erişime izin vermek için.</li>
	<li>Juguler ven yalıtmak için ince forseps kullanın ve yavaşça aç ve yavaşça çevreleyen doku gemiden boşaltmak için kapatın. Damarı tamamen temiz olduğunda, forseps geminin altında konumlandırmak ve iki 7-0 dikişler altındaki her 10 cm yerleştirin.</li>
	<li>Proksimal iki deniz mili ile kafasına dikiş kapatın. Diğer dikiş bir düğüm hazır olun ama yakın değil.</li>
	<li>Tek elle Forseps ile 37 ° C steril serum fizyolojik ile dolu kateter (0,28 mm iç çapı, 0,61 mm dış çap) tutun; diğer elinizle iken, ince makas veya eğri 26 G iğne ile geminin küçük bir insizyon attım olun. Sonra kateter juguler ven yerleştirin ve düğüm iki kez kapatın. Proksimal kafasına dikiş tam immobilizasyon sağlamak için kateter kapatın.</li>
	<li>Yalıtmak ve Karotid arter hazırlamak için ince kavisli forseps kullanarak Trakea kapsayan alan incelemek.</li>
	<li>Şahdamarı dokuları çevreleyen boş olduğunda, vagus siniri (beyaz çizgi için karotis bitişik gibi görünüyor) gemisinden kaldırmak (ama işlevsel değil). İnce forseps kapalı ve yavaş yavaş yavaşça sinir harekete geçirmek için açtı.</li>
	<li>Her iki damar tamamen temiz olduğunda, ilk Karotid arter altında forseps yerleştirin ve bir küçük siyah 3 mm geniş x 2.5 cm uzunluk plastik parça geminin altında yer. Gemi overstretch yok ve kan akışını gemi sahibi yerleştirilir bir kez yüklü olduğunu kontrol etmek için çok önemli. İkinci arter gemi sahibi yerleştirin. Fareyi doğrudan altında mikroskop yerleştirilmez bezleri nefes borusu koy ve 37 ° C steril serum fizyolojik bölgenin kurutma önlemek için geçerlidir.</li>
</ol>
4. haddeleme ve lökosit kalarak değerlendirmesi / LysM + hücreleri IVM ile
<ol>
	<li>Turuncu-20 ° C'de depolanan bir 2 mg/mL stok çözümden akridin hazırlamak ve 1: 4'te 1 mL şırınga steril serum (0,5 mg/mL nihai toplama) oranında seyreltin.</li></ol>Işık--dan belgili tanımlık tenkıye korumak ve bir fare başına 200 µL kullanın.<ol>
		<li>Test farklı koşullar: akridin Şah sondayla; portakal (1) enjeksiyon (2) enjeksiyon akridin turuncu doğrudan içine kuyruk lateral damar (ile bu durum) hiçbir Şah kateter implante; (3) ölçüm akridin floresan LysMCre+IRG+ kullanarak turuncu fareler (Şah yok kateter implante burada tekrar) olmadan.</li>
	</ol>
	
	<li>Kateter yer ve iki de izole sonra mikroskop altında fare yerleştirin. Uzun mesafeli bir kondansatör ve 10 X kullanarak yüksek hızlı geniş alanlı floresan mikroskop ile ölçümleri gerçekleştirmek (NA 0,3) su daldırma amacı bir monokromatör, bir ışın ayırıcı ve bir şarj kuplajlı cihaz kamera ile. Resim alma ve gerçek zamanlı görüntüleme sistemi ile analizi gerçekleştirin.</li>
	<li>Karotid arter endotel yüzeyinde ortasında mikroskop objektif odak. Yavaş yavaş, akridin turuncu 50 µL (0,5 mg/mL) (ilk enjeksiyon için kateter ölü hacmi dikkate almak) enjekte et. Resim başına 120 milisaniye bir çekim hızı ile 100 adet fotoğraf kaydetmek için yazılım ayarlayın.</li>
	<li>Her video için arter üzerinde farklı yerlerde Karotid arter (sol ve sağ) başına dört videoları olun. Floresans sinyal azalırsa, akridin turuncu başka bir 50 µL enjekte et.</li>
	<li>Tüm videoları kayıt sonra hayvan tarafından servikal çıkığı ötenazi.</li>
	<li>Video hızı saniyede 10 kare ayarlamak ve her video için gemi ortasında yerleştirilen 200 µm x 250 µm dikdörtgen görünümü'nde çalışırken ve yapışık hücreleri ölçmek. Haddeleme ve yapışık hücreleri saymak; yapışık hücreleri taşımayın veya 10 s video içinde endotel dan ayırmak hücreleri olarak tanımlanır. Miktar kolaylaştırmak için kanal ile kırmızı Floresans kaldırmak ve sadece yeşil Floresans haddeleme ve yapışan hücreleri saymak için kullanın.</li>
	<li>Akridin turuncu kullanarak deneyler için Floresans manuel bir eşiği endotel hücreleri tarafından yapılan arka plan çıkarmak için olun.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

LysM+ monosit daha önce hipertansiyon5gelişiminde karıştığı gösterilmiştir. İşte LysM+ bağışıklık hücreleri rulo ve yanıt AngII infüzyon olarak endotel katmanı uygun göstermektedir. Bu bulgu LysMCre+IRG+ kullanarak elde edildi fareler hipertansiyon vivo içinde bağışıklık hücrelerinin rolü lökosit enjeksiyon akridin turuncu6,10ile görselleştirme tarafından keşfetmek bizim önceki çalışmalar. Böylece, ayrımcılık kalarak için endotel hücre tiplerinin mümkün değildi.
IVM damar çalışmalar ve in vivo gözlemler damarlara doğrudan hücre için çok yararlı bir araçtır, ancak hipertansiyon inflamatuar bağlamında cerrahi olarak eklenen bir kateter yardımıyla boya enjekte etkisi bilinmeyen kalır. Kateter ve akridin turuncu potansiyel etkisini değerlendirmek için enjeksiyon biz IRG+ fareler LysMCre+avantajı aldı. AngII infüzyon sayısı arttı LysM+ hücreler endotel için inişli çıkışlı. Bir kateter juguler ven içine ekleme etkisi güçlendirilmiş ve daha haddeleme ve yapışan lökosit kateter implantlar olmadan fareler karşılaştırıldığında bir kateter ile Enstrümante AngII-infüzyon farelerde tespit edildi. Bu o implantasyonu bağlamında, sistemik inflamatuar reaksiyon kaplayan hipertansiyon18' görülen bağışıklık reaksiyonu ile yaranın Karotid kateter nedenleri gösterir. Buna ek olarak, juguler ven şahdamarını için yakınlık nedeniyle ek bir bağışıklık etkinleştirme juguler ven etkileyen tarafından oluşmuş olabilir. Bu etkinin ne zaman iğne kuyruğu damar içine yapılan mevcut değildi beri biz etkisi nedeniyle varsayabiliriz boya ama kateter ekleme yordamı değil. Biz burada in vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.
Bir kritik yordam AngII infüzyon adımdır. Kuyruk manşet değerlendirme kan basıncı AngII teslim etkinliğini denetlemek için pompa tarafından yapılabilir. Kan basıncı infüzyon 2−3 gün sonra artırmalıdır. LysM+ hücreleri harekete geçirmek etkileyen enflamasyon sınırlamak için nerede pompa implante kesi kapatılması dikiş yerine klipleri ile yapılmalıdır. Bir sınırlama kuyruk ven enjeksiyon hakkında kaydetti: en iyi olası veri toplama yapmak için 4 video genellikle her şahdamarı için alınır. Floresan sinyal azalırsa, akridin Orange 50 µL enjekte ama kuyruk enjeksiyon ile birkaç iğne yapmak ve şahdamarı mikroskop objektif altında sabit tutmak için daha zor. Juguler ven bir kateter varlığı süresi 4 saat sonra kateter implantasyon19hazırlanan trombosit açısından zengin plazma koagülasyon aktivasyonu etkiliyor bu yana, bağışıklık hücreleri harekete geçirmek de modüle. Kateter implantasyon bu yönünü daha fazla araştırma gerekiyor.
Bile LysM+ hücre aktivasyonu AngII infüzyon sonra Şah kateter Uygulanılmasından etkisini takdir ediyoruz, son olarak, biz tam olarak hazırlık, cilt temizleme ve potansiyel bir LysM+ hücre üzerinde karotis yalıtım rolü tahmin olamaz harekete geçirmek. Biz Floresans muhabir fare kullanımı böyle sonucuna LysMCre+IRG+ fare gemi bütünlük bozulma vivo içinde görüntüleme için hayvan hazırlık sırasında önlemek için tavsiye edilir.

Arteriyel hipertansiyon kardiyovasküler hastalık ve ölüm riskini artırır ve ateroskleroz, koroner kalp hastalığı ve atardamar veya toplardamar thromboembolisms1gelişimini teşvik etmektedir. Hipertansiyon gelişimini çevresel, genetik, endokrin ve hemodinamik faktörlerin etkileşimi üzerinde bağlıdır. Şu anda, bağışıklık ve ilgili iltihap hipertansiyon2etyoloji içinde önemli bir rol oynamak için takdir edilmektedir.
Bağışıklık hücreleri arasında T lenfositler yanı sıra monosit ve makrofajlar AngII kaynaklı damar iltihabı ve hipertansiyon, kısmen Reaktif oksijen türleri3tetiklemek için yeteneklerini ilgili nedensel dahil olmak bulundu. Makrofaj koloni uyarıcı faktör eksik fareler kan basıncı artışı ve damar iltihabı4ile ilgili AngII için azaltılmış tepki gösterdi. Bir önceki çalışmada, LysM + monosit vasküler disfonksiyon ve iltihap AngII kaynaklı hipertansiyon5' te sürücü gösterebilirim. Daha yakın zamanlarda, açıkladığımız bir roman yol hangi koagülasyon faktör XI trombosit ve Trombin bağlı damar iltihabı6ikna etmek için damar duvarı ile işbirliği yapmaktadır. Hipertansiyon bağışıklık sisteminde rol hakkında güncel bilgi son zamanlarda özetledi ve Rodriguez-Iturbe ve arktarafından incelendi. 7
Bağışıklık hücreleri hipertansiyon gelişiminde katılımı oldu beri modelleri ve teknikleri gemi ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için gerekli oldu. Epifluorescence IVM kan damarlarının dolaşan kan hücreleri ve endotel8,9,10arasında vivo içinde etkileşim gözlemlemek için yararlı bir araçtır. Bu teknik ile DNA'sını (akridin turuncu gibi) enterkalasyon boyalar enjeksiyon çekirdekli hücreler (dolaşımdaki yanı sıra endotel) görselleştirebilirsiniz. İzole trombosit ex vivo ile rhodamin - 6 G lekeli veya dichlorofluorescein (DCF) trombosit açısından zengin trombüsü atardamar veya toplardamar yaralanma modellerinde görselleştirmek için enjekte edilebilir.
Genellikle, juguler ven kateteri izleyiciler enjekte için kullanılan veya işaretli trombosit. Endotel İLETİMLERİNİZE ve koagülasyon cascade, sonraki harekete geçirmek her ikisi de bilinmektedir monosit etkinleştirme üzerinde etkiler. Endotel hasarı hemen trombosit harekete geçirmek subendothelial matris molekülleri takip eden monosit cazibe ve harekete geçirmek11ile doku mühür yol açar. Aksine, bir sağlam endotel antikoagülan özellikleri (Örneğin, doku faktörü yolu inhibitörü veya thrombomodulin yoluyla)12 ve monosit, örneğin, üzerinden salgılanmasını üzerinde doğrudan inhibitör etkileri olduğu bilinmektedir hücre dışı veziküller mikroRNA'lar13içeren. Monosit bir doku faktörü, koagülasyon cascade ve Trombin tarafından etkinleştirilebilir ve monosit harekete geçirmek14' te,15 katılmak hızlı proteaz aktif reseptörleri (PARs) dışsal aktivatör üretmek bilinmektedir . Bu nedenle, herhangi bir etkinleştirme trombosit veya vasküler yaralanma nedeniyle koagülasyon cascade olabilir monosit etkinleştirme üzerinde beklenmeyen etkileri ve gözlenen fenomen ile müdahale. LysM+ bir kateter ve alternatif yöntemleri ile enjeksiyonlar etkisi ayrıntılı olarak incelemek önerdiğimiz IRG transgenik LysM Cre transgenik fareler, bir çift-floresan Cre muhabir fare (LysMCre+IRG+) sayesinde, myelomonocytic hücreleri, arteriyel hipertansiyon16bir fare modeli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

Epifluorescence intravital video mikroskobu (IVM) kan damarlarının bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve rol için yeteneklerini değerlendirmek ve endotel katmana bağlı kurulan bir yöntemdir. Hücreleri floresan boyalar veya fluorophore birleştiğinde antikorlar enjeksiyonu ile dolaşan görselleştirme yaygın olarak kullanılır. Alternatif olarak, floresan muhabir fare-ebilmek var olmak kullanılmış. + (LysM+) etkileşimleri lökositlerin, belirli lizozim M monosit, gemi duvar ile vasküler disfonksiyon ve arteriyel hipertansiyon desteklenmesinde önemli rolleri oynamak. Burada görselleştirmek ve haddeleme lökosit ve Anjiyotensin II (AngII) karotis arterlerde yapışma ölçmek için teknik mevcut-hipertansiyon farelerde IVM tarafından indüklenen.
Bir kateter implantasyonu vasküler duvar zarar ve değiştirilmiş kan hücresi yanıt-e doğru yol açar. Biz farklı enjeksiyon teknikleri ve bir LysMCre+IRG+ lökosit görselleştirmek için yönetim yolları göre fare ile kırmızı floresan protein yaygın ifade ve LysM yeşil flüoresan proteinin koşullu ifade + hücreleri. LysM+ hücre aktivasyonu, biz AngII fareler infüzyon çalışırdım içinde inişli çıkışlı ve yapışma lökositlerin endotel artar. Biz de akridin bir Şah kullanarak turuncu kateter enjekte veya doğrudan kuyruk damar ve miktarını karşılaştırıldığında haddeleme ve kalarak hücreleri. Şah kateter implantasyon başına haddeleme sayısı arttı ve yapışan LysM+ hücrelerde sham infüzyon-LysMCre+kontrollere göre IRG+ fare bulduk. Bu harekete geçirmek AngII-infüzyon farelerde artar. İlginçtir, akridin doğrudan kuyruk damar artış LysM+ turuncu hücre adezyon enjekte veya sahte-infüzyon farelerde haddeleme. Böylece vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.

Şahdamarı LysMCre+IRG+ AngII ile infüzyon fareler IVM kullanarak gözlendi. Akridin turuncu Şah bir kateter kullanarak enjekte ettiler. LysM+ hücreleri ile temas (açık bir ayrımcılık teknesi ile etkileşim hücre türü kaldı bu yana hangi Ayrıca gemi ile etkileşim tüm çekirdekli dolaşımdaki hücrelere kıyasla vasküler duvar oranının bakmak amaçlanmıştır soru--dan bizim önceki iş). Temel Şah bir kateter varlığı (şekil 2A, D) LysM+ hücrelerinin yapışma neden olur. Akridin turuncu enjeksiyon sonra aynı hücreleri Floresan, ama aynı zamanda endotel hücreleri floresan idi (şekil 2B, E). Endotel sınırlamak için arka plan azalma Floresans ilgili sonra verileri tüm çekirdekli yapışan hücreleri LysM+ (şekil 2C, F); olduğunu gösteriyor Bu sonuçlar bizim önceki sonuçları onaylamak ve+IRG+ LysMCre AngII LysM+ hücre aktivasyonu üzerindeki etkisini gözlemlemek için iyi bir model olduğunu gösteren AngII infüzyon sonra doğru tutun.
Biz rol akridin portakal LysM+ hücre aktivasyonu LysMCre+IRG+AngII infüzyon sonra üzerinde yönetim yollarının değerlendirildi. AngII infüzyon, lökosit endotel etkileşimleri, bir hafta sonra LysMCre+IRG+ Karotid arterler fareler görüntüsü ve ile ya da ezelî akridin turuncu enjeksiyon Şah bir kateter veya kuyruk ven yoluyla IVM tarafından görüntülenmiştir. AngII infüzyon tedavi edilmezse fareler ve yapışma göre (şekil 3) artış gösterdi sonra herhangi bir kateter veya iğne olmadan LysM+ hücrelerinin haddeleme önemli ölçüde arttı. Enjeksiyon akridin Şah kateter arttı yapışma ve AngII içinde haddeleme ile turuncu fareler fare olmadan bir kateter (şekil 3) ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde tedavi. Akridin kuyruk damarda turuncu enjeksiyon benzer yapışma sağlar yol açar ve haddeleme akridin turuncu (şekil 3) enjeksiyon almadı fareler karşılaştırıldığında.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Şekil 1. Düzeni Anjiyotensin II infüzyon ve LysM+ değerlendirilmesi için haddeleme ve yapışma farelerde hücreleri. LysMCre+IRG+ fare AngII ile 7 gün infüzyon ve kalarak hem de LysM+ haddeleme şahdamarı hücreye veya enjeksiyon akridin turuncu Şah bir kateter ile mi yoksa kuyruk ven olmadan sayısal enjeksiyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Şekil 2. LysM+ hücre adezyon ve LysMCre+Karotid arterler IRG+ fare haddeleme değerlendirilmesi. LysM yapışma+ hücreleri LysMCre+IRG+ fareler (A, D) önce ve sonra (B, E) akridin enjeksiyon yolu ile Şah bir kateter. Kırmızı ve yeşil Floresans kaydedildi, LysM+ hücrelerinde (yeşil) ve düz kas hücrelerinde (kırmızı) görünür. Enjeksiyon akridin Orange sonra endotel hücreleri de yeşil görülebilir ama arka plan Floresans tek dolaşan hücre görselleştirme (C, F) parçalanmayabilir mümkün kılar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Şekil 3. Anjiyotensin II floresan boyalar olarak yönetim yolları değerlendirilmesi IRG+ fareler LysMCre+infüzyon. Miktar haddeleme(a)ve (B) LysM+ kalarak hücreleri ve işletilen sahte veya AngII-infüzyon hayvanlar veya enjeksiyon akridin Orange Şah bir kateter kullanarak veya kuyruk ven enjeksiyonla olmadan. Farklı koşullarda (C) temsilcisi resimleri. Ortalama ± standart hata ortalamaya sonuçlarıdır. 2 yönlü ANOVA gerçekleştirilen ve Bonferroni'nın post hoc testi, n = 3-12/gruplar; p &#60; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Etiket-ücretsiz Biyosensör Teknolojisi kullanılması Meme Kanserinde İnsan Lökosit Antijen BİYOMARKÖRLERİN Algılama

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...