Name: in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

Vi takke Jean-Baptiste Sibarita og Daniel Choquet (IINS, CNRS/University of Bordeaux) for deres venlige støtte med enkelt-molekyle analyse. Vi takker især Nick Valmas og Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) for deres hjælp med video optagelse, voice-over samt finde grafisk design. Dette arbejde blev støttet af projektets australsk forskning Rådet (AR) opdagelse (DP170100125 til F.A.M.), det australske Forskningsråd (LIEF Grant LE0882864 til F.A.M.), fremtiden Fellowship (FT100100725 til B.V.S.), australske Forskningsråd (LIEF Grant LE130100078 til F.A.M.) og NHMRC projekt (APP1103923 til B.V.S.). F.A.M. er en NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. design af transgene Drosophila udtrykker mEos2-mærkede protein
<ol><li>Vælg protein til at være mærket med mEos2 protein. For at øge den billeddiagnostiske succesrate, Vælg proteiner med en transmembrane domæne i de neuronale plasmamembran14 (f.eks.Syntaxin-1A), proteiner på synaptiske vesikler eller autophagosomes26,27 (f.eks. Synaptobrevin-2), eller cytosole proteiner med tæt samspil med neuronal plasma Membranproteiner (f.eks.Munc18-1).</li>
	<li>Konstruere transgener kodning af mEos2-mærkede protein (figur 1). Design frem og bak primere for protein og mEos2. Bemærk: MEos2 kodende sekvens kan blive forstærket fra pmEos2-N1 plasmidet, som er designet til at lunte til C-terminus protein af interesse. Kloning kan f.eks udføres af i vivo rekombination i Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af pFL44S-attB-MCS-w + vektor14,28, skiftevis andre kloning metoder kunne anvendes som Gibson forsamling protokol29.<ol>
<li>Linearize vektor med BamHI og XbaI og co omdanne ura3 - gærceller sammen med PCR fragmenter kodning mEos2 og protein af interesse. Injicere Drosophila embryoner med konstruktion til at generere en transgene fluelinen30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bag de transgene flyve kulturer på standard gær og melasse medium eller nogle andre passende erstatning i plastik hætteglas. For at sikre sunde og temmelig store synaptic boutons31, undgå overfyldte fluer i hætteglassene og flip fluer til nye hætteglas efter hver dag med æglægning; Dette sikrer de tredje instar larver fodres godt og nå korrekt størrelse på det tidspunkt de begynde vandre på mellemlang. Hæve den transgene flyve ved stuetemperatur (25 ° C). Bemærk: Større synaptic boutons tendens til at give større mængde proteiner visualiseret under imaging.</li>
</ol>2. dissektion af tredje Instar larve
<ol><li>Gøre en cylindrisk eller semicylindrical formet Polydimethylsiloxan (PDMS) base ≤20 mm i diameter og ≤20 mm i højden ved hjælp af en passende silikoneelastomer kit (figur 2A). Bland silikoneelastomer med en silikone hærdning agent i forholdet 10:1.<ol>
<li>Rør blandingen grundigt i 5 min. Hæld blandingen i en form med dimsensions listet ovenfor. Lad det hærde i en ovn ved 100 ° C i 45 min. PDMS base vil tjene som fundament at udføre dissektion. Sikre PDMS base passer ind i godt af en glas-bund kultur parabol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg en omvandrende tredje instar larve fra hætteglas væg. Brug et optisk stereo-mikroskop på 4,5 forstørrelse til at visualisere larve placeret på PDMS cylindrisk base med den dorsale side op.</li>
	<li>Brug buede og vinklet pincet til at holde minutien pins på hovedet over munden kroge, mellem de to udvide forreste Spirakler, og på halen over anus, mellem de to bageste Spirakler. Tilføje 40 µL af Schneiders insektvoks mellemstore ved stuetemperatur på de immobiliserede larve. Bemærk: Hemolyph-lignende løsninger (HL3 eller HL6) kan også bruges stedet Schneiders løsning32,33.</li>
	<li>Give adgang gennem den dorsale side af kroppen bugvæggen af larve ved brug af en minutien pin til incise i midterlinjen af væggen.</li>
	<li>Brug foråret saks til at klippe kroppen væggen åbne fra punktet indsnit. Skær langs midterlinjen i anterior-posterior retning34.</li>
	<li>Brug fine pincet og foråret saks til at opskære larve: fjerne de indre organer, herunder spytkirtler, luftrør og gut. Vask larve to gange med Schneiders insekt medium.</li>
	<li>Med fine pincet, hold de to kroppen væggen flaps, forsigtigt strække dem ud og holde to minutien ben på hver side. Dette bør resultere i en sekskant-formet forberedelse (figur 2A).</li>
	<li>Frigøre hjernen fra ventrale nerve ledningen ved hjælp af foråret saks til at mindske muligheden for muskelbevægelser under imaging; Dette tjener også til at hold forberedelse fladt mod imaging fadet. Brug den buede pincet til at skubbe alle seks minutien ben til PDMS base. Bemærk: Kun en lille del af benene skal være indlejret i bugvæggen.</li>
	<li>At bekræfte, at larve har overlevet dissektion procedure, lidt stikke den ventrale nerve ledningen, skal det fremkalde en peristaltiske sammentrækning af larve bugvæggen.</li>
</ol>3. lidt skrå belysning enkelt-partikel Tracking mikroskopi
<ol><li>Invertere dissekeret larve-PDMS base på en glas-bund kultur parabol. Fyld imaging fadet med 2 mL af stuetemperatur Schneider insekt medium (figur 2B).</li>
	<li>Find motor neuroner i de anden og tredje segmenter med synapser på mavemusklerne 6 og 735 ved hjælp af de 63 x / 1.2 NA vand-fordybelse mål på et fluorescerende total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskop.</li>
	<li>Brug okularer af mikroskop til at finde de dissekerede larve; identificere muskel 6 ved brug af lysfelt belysning.</li>
	<li>Bruge mikroskop erhvervelse software (Se Tabel af materialer), i JOHANNAS konfiguration; Skub kollimator kameravinkel til 1° til at øge indtrængningsdybde, ellers flytter ud af JOHANNAS kritisk vinkel at opnå skrå belysning.</li>
	<li>Tænd 488 nm laser til at visualisere mEos2 i grøn. Brug en lav laser power (mindre end 5% af 22,8 mW) at undgå blegning den grønne fluorescens. Find de neuromuskulære vejkryds (som ligner perler på en snor) og erhverve en lav opløsning JOHANNAS billede.</li>
	<li>Samtidig skifter på 405 nm laser (photoconverts mEos2 fra grøn til rød arter) og 561 nm laser (billede photoconverted rød mEos2) til stochastically lokalisere enkelt mEos2 fluorescerende proteiner. Bemærk: Brug af lav 405 nm laser power anbefales (0,005 til 0,9% af 4.78 mW) da dette giver mulighed for en relativ konstant photoconversion sats under filmen erhvervelse. Brug mellem 50 og 75% af 561 nm laser (20.1 mW), da dette er tilstrækkeligt til at erhverve fluorescens fra røde mEos2 arter uden at skade morfologi af muskelvæv omkring den neuromuskulære junction.</li>
	<li>For hver kæde, neuromuskulære junction, erhverve gangen serien består af 15.000 rammer eller mere ved 33 Hz. Gem as.czi format for at bevare den ledsagende meta-data for mulige reference.</li>
	<li>Brug ImageJ at konvertere '.czi' filmfiler til '.tiff' filer.</li>
	<li>Analysere de erhvervede film med passende enkelt-molekyle tracking analytisk software11,14,36 såsom TrackMate på FIJI/ImageJ37 (Se Tabel af materialer). Lokaliserer 'x' og 'y-koordinaterne for hvert lokalisering af de Gaussian anfald af intensitet punkt spredes funktion (PSF). Bemærk: fejlfinding: Hvis grønne fluorescens ikke er observeret eller er for svagt på den neuromuskulære junction ved udsættelse for 488 nm laser, kort skifte på photoconverting og imaging lasere (405 nm og 561 nm), da dette bidrager til at producere mere af røde arter af mEos2. Derefter skifte tilbage til 488 nm laser og tage en JOHANNAS billede.</li>
</ol>4. enkelt-molekyle lokalisering i faste larver
<ol><li>For at måle protein nanocluster størrelse via PALM, skal du erstatte den Schneiders insekt medium efter dissektionen med et fiksativ - 4% PARAFORMALDEHYD opløses i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).</li>
	<li>Inkuber larve i 30 min. ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjern dissektion stifter og placere de faste larve i en 1,7 mL klart snap-lock microcentrifuge tube.</li>
	<li>Dissekere og fix som mange andre larverne efter behov, så vasker dem tre gange med PBS.</li>
	<li>Erstatte PBS med blok buffer (en løsning af PBS, 0,1% Triton X-100 og 3% normal ged serum).</li>
	<li>Vask larver med PBS tre gange, derefter inkuberes med den nødvendige primære antistof (fortyndet i blok stødpudeopløsning).</li>
	<li>Der inkuberes natten over ved 4 oC.</li>
	<li>Vask larver tre gange med PBS, så inkuberes med den nødvendige sekundær antistof (fortyndet i blok stødpudeopløsning).</li>
	<li>Vask larver tre gange med PBS, vedhæfte larve tilbage på PDMS base, og billedet som tidligere beskrevet for enkelt-molekyle tracking.</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne protokol beskriver enkelt-molekyle sporing af mEos2-mærkede proteiner på den neuromuskulære junction i Drosophila tredje instar larve. For at undgå overdrevne udtryk af transgene protein, var Syntaxin-1A-mEos2 udtryk drevet af endogent Syntaxin-1A promotor. Undersøgelser af synaptic protein mobilitet er for det meste blevet begrænset til in vitro- undersøgelser af dyrkede celler og kortikale neuroner9,11,12,13. Om disse proteiner udviser lignende mobilitet signaturer i et levende dyr er stort set ukendt. For at visualisere single-protein mobilitet i vivo, har begrænsninger såsom optiske gennemsigtighed, tilgængelighed og penetration dybde skal overvindes. Ved at dissekere den larve forberedelse og visualisere neuromuskulære udfletningerne indlejret på overfladen af musklen, undgå vi spørgsmålet om optisk gennemsigtighed og tilgængelighed. Forsøg at billedet enkelt-molekyle mobilitet i normale JOHANNAS konfiguration viste sig forgæves. Men brug lidt skrå belysning giver mulighed for øget excitation laser gennemtrængende dybde. Derudover minutien nåle bruges til at immobilisere larve bidraget til at undgå enhver mulig negativ virkning af bedøvelse brug på protein mobilitet. Det er muligt at bruge højere forstørrelse mål, såsom 100 x olie fordybelse mål, til at visualisere enkelt molekyler in vivo. Men øget forstørrelse kan øge forekomsten af driver ude af fokus. Derudover har vi brugt en lavere intensitet (~ 30%) 561 nm laser med held at billedet enkelt molekyler på motoriske nerve terminaler. Yderligere undersøgelser kan være nødvendigt at bruge lavere laser power.
Denne protokol er velegnet til at visualisere mobilitet af synaptic proteiner i nærhed af neuronal plasmamembran. Brug denne fremgangsmåde, mobilitet af SNARE protein - Syntaxin-1A og autophagosome bundet protein Atg18a - har været succesfuldt afbildet in vivo14,26. Mobilitet af proteiner på motor neuron axons kan også blive undersøgt27. Men undersøgelsen af mobilitet af proteiner i hjernen eller ventrale nerve ledningen kan vise sig vanskeligt at vurdere på grund af den høje baggrund signal produceret af det underliggende væv; Derudover visualisere protein mobilitet på samme hjerne struktur vil kræve fluorescently tagging hjerne struktur (for at sikre replikerbarhed), og brugen af dobbelt-kamera billedbehandling ville være nødvendig.
Nuværende metoder til Super-resolution mikroskopi i Drosophila er for det meste begrænset til billedbehandling embryoner, snarere end mere udviklede tredje instar larve38,39. Det største problem med disse protokoller er at give et lavt antal baner i området afbildet, og dermed forhindre dybdegående analyse af mobilitet stater22,40. Vores i vivo enkelt molekyle tracking protokollen har kapacitet til at generere et stort antal baner, og kan derfor anvendes i andre dyremodeller såsom Caenorhabiditis elegans og zebrafisk. Faktisk genereret hver NMJ kæde ~ 2.400 baner gør det egnet til at analysere forskellige mobile tilstande og overgange mellem disse stater14,27. Derudover mange i vivo enkelt molekyle imaging strategier er afhængige af brugen af anæstetika til at immobilisere den dyr20,22, som kan ændre den fysiologiske funktion, hvorunder billeddannelse sker. Her optimeret vi en 'anæstesi-fri' protokol for at immobilisere larverne ved hjælp af minutien pins.
En potentiel anvendelse af denne protokol kan være til at visualisere mobilitet af proteiner i tre dimensioner. De seneste fremskridt i Super-resolution mikroskopi tillade protein mobilitet skal være visualiseret i vitro i 'x', 'y', og 'z' dimensioner41,42. Vores nuværende metode tager ikke højde for mobilitet af proteiner i "z-akse. Endnu Drosophila motoriske nerve terminal er en kugleformet struktur og en værdifuld fremtidige tilgang vil være at kvantificere protein mobilitet i en tre-dimensionel volumen43. Billedbehandling i z-dimension er muligt ved hjælp af en Astigmatisk linse. Alternativt, JOHANNAS tilstand44,45, z-opløsning er også steget. Men i vores forsøg, har vi brugt lidt skrå belysning for at visualisere enkelt molekyler af syntaxin1A-mEos2 uden Astigmatisk linse.
Afslutningsvis, tilgængeligheden af både en transgene Drosophila flyve bestand udtrykte proteiner markeret med et photoconvertible protein, et PDMS base at dissekere de transgene larve, samt en JOHANNAS mikroskop udstyret med mulighed for at ændre den vinkel belysning er de vigtigste nødvendige værktøjer til at visualisere enkelt proteiner som beskrevet i denne protokol.

Neuronal kommunikation bygger på neurotransmitter frigivelse, som opstår gennem de regulerede fusion af neurotransmitter-holdige synaptiske vesikler med plasma membran1. Denne proces kaldes exocytose2,3,4,5,6 er meget dynamisk og kan blive op - eller nedreguleret ifølge udsving i antallet af stimulation7. Proteiner involveret i disse processer er underlagt Brownske bevægelser, og derfor vise nanostørrelse organisation i stand til at opretholde en række bindende foranstaltninger, der underbygger disse fysiologiske funktioner. Plasma Membranproteiner er meget dynamisk, giver mulighed for lateral diffusering af molekyler i nanoclusters på plasma membran7,8,9,10,11, 12. Som sådan, undersøger mobilitet af disse proteiner hjælper med at belyse deres tilstand af aktion8. Synaptic proteiner som de opløselige N-ethylmaleimide følsomme faktor vedhæftet fil protein receptorer (snarer), for eksempel Syntaxin-1A, vides nu at udstille laterale hurtig mobilitet samt lateral fældefangst inden for nanoclusters, der kan tjene som Molekylær depoter og websteder for vesikel fusion9,13,14,15.
Den seneste udvikling af photoconvertible fluorescerende proteiner, såsom monomere (m) Eos16,17 og Kaede18, har tilladt nanostørrelse opløsning af neuronal plasma Membranproteiner ved hjælp af tilgange sådanne som foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)14,15,19. Disse udviklinger har aktiveret undersøgelser af mobilitet og nanoclustering af biologiske proteiner i kulturperler levende celler og neuroner. På det seneste har er undersøgelser blevet udført for at belyse (på lignende høje opløsninger) dynamics og organisation af disse Membranproteiner i neuroner i live intakt organismer sådan Mus musculus, Caenorhabditis elegans, og Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersøger dynamics og organisation af et protein i vivo kræver ikke kun brugen af nyligt udviklede super-resolution billedbehandling værktøjer (såsom PALM, STORM og photoconvertible fluorophores), men også evnen til at overvinde hindringer sådanne som tilgængelighed af protein og indtrængningsdybde af imaging laser. Imaging intracellulære proteiner i en intakt dyr er i sagens natur udfordrende som imaging proteiner på strukturer indlejret dybt i levende væv i det intakte dyr, som hippocampus en intakt mus. Dermed er proteiner på eller tæt på overfladen af vævet mere let afbildet. En anden vanskelighed med imaging i vivo er at sikre reproducerbarheden på tværs af dyr. Som anatomi kan afvige fra én prøve til den anden, kunne at vælge en struktur med lethed af replikering i forskellige intakte dyr prøver også være udfordrende. Brugen af stereotype strukturer, såsom synapser, hjælpe med at overvinde nogle af disse vanskeligheder.
Nylige undersøgelser har afbildet protein mobilitet i dyr med en optisk gennemsigtig epidermis såsom Caenorhabditis elegans22, mens andre undersøgelser har afbildet protein organisation på overfladen af en væv/organ, for eksempel aktin imaging i kortikale neuroner gennem kraniet af en levende mus21. I nogle tilfælde, er anæstetika blevet brugt til at holde dyret immobile; imidlertid privatpersons specifikke anæstetika protein af interesse. Alternative midler til at holde dyr immobile under i vivo billeddannelse bør derfor undersøges for at minimere fejl.
En anden advarsel til Super-resolution billedbehandling i vivo er at lasere anvendes til at belyse proteiner af interesse kunne påvirke det omgivende væv, og dermed holde excitation intensiteten så lav som muligt anbefales. Belysning af det omgivende væv af laser også en tendens til at øge baggrunden signal. Brug af lav excitation intensitet hjælper med at reducere baggrunden, det forbehold, at det kunne også føre til et fald i fluorescerende proteiner photon udbytte. Baggrund subtraktion under analysen kan anvendes som alternativt middel til at reducere baggrund signal før billedanalyse.
Drosophila præsenterer en ideel organisme for i vivo billeddannelse som indeholder det veletablerede genetiske værktøjer for undersøgelse af specifikke protein funktion. Den upstream aktiverende sekvens (UAS)-Gal4 system giver tidsmæssige og rumlige udtryk af proteiner og kan derfor bruges til at manipulere neurotransmission23, sådan at thermo-genetiske stimulation ved hjælp af Drosophila forbigående receptor potentielle undergruppen A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiske stimulation ved hjælp af far-rød-forskudt CsChrimson25 kan kombineres med billedbehandling14. Vi har overvundet mange af komplikationer af udfører i vivo enkelt-molekyle imaging i dette system og nu beskrive hvordan enkelt-partikel tracking kan udføres i Drosophila melanogaster tredje instar larver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

Et stigende antal super-resolution mikroskopi-teknikker er med til at afdække de mekanismer, der styrer nanoskala cellular verden. Enkelt-molekyle imaging er vinder momentum, da det giver enestående adgang til visualisering af individuelle molekyler i levende celler. Her, beskriver vi en teknik, som vi udviklede for at udføre enkelt-partikel tracking foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptic kommunikation bygger på centrale præsynaptiske proteiner, der fungerer ved docking, grunding og fremme fusion af neurotransmitter-holdige vesikler med plasmamembran. En vifte af protein-protein og protein-lipid interaktioner regulerer stramt disse processer og de præsynaptiske proteiner derfor udviser ændringer i mobilitet forbundet med hver af disse vigtige begivenheder. Undersøge, hvordan mobilitet af disse proteiner korrelerer med deres fysiologiske funktion i en intakt levende dyr er nødvendigt for at forstå deres præcise virkningsmekanisme. Udvinde protein mobilitet med høj opløsning i vivo kræver at overvinde begrænsninger såsom optiske gennemsigtighed, tilgængelighed og indtrængningsdybde. Vi beskriver, hvordan photoconvertible fluorescerende proteiner markeret til den præsynaptiske protein Syntaxin-1A kan visualiseres via lille skrå belysning og spores på den motoriske nerve terminal eller langs motorneuron axon af tredje instar Drosophila larve.

Ved hjælp af protokollen anførte ovenfor, Syntaxin-1A-mEos2 transgene Drosophilamelanogaster blev genereret (figur 1). Transgene tredje instar Drosophila larver var dissekeret på PDMS cylindrisk base (figur 2A-F). For at visualisere enkelt molekyler af Syntaxin-1A, brugte vi PALM på JOHANNAS mikroskop med lidt skrå laser belysningsstyrke14.
Enkelt molekyler af Syntaxin-1A blev sporet på de præsynaptiske motoriske nerve terminaler på muskel 6 i det andet abdominal segment. Den grønne fluorescens af mEos2 kunne påvises, som det fremgår af Syntaxin-1A-mEos2 med lav opløsning billedet på type 1b boutons når ophidset, ved hjælp af 488 nm laser (figur 3A). I de billeddiagnostiske eksperimenter, 405 nm og 561 nm excitation laser imaging dybder blev 133.5 nm og 165.6 nm, henholdsvis. Den grønne image blev erhvervet som et gennemsnit af 16 enkelte frames. Denne grønne image blev brugt til at oprette det pågældende område, bruges til at begrænse analysen af lokaliseringer i photoconverted filmen til de præsynaptiske motoriske nerve terminaler alene.
Analysen af de erhvervede photoconverted sptPALM film genereret en super-løst intensitet, diffusion koefficient, og bane kort (figur 3A). Syntaxin-1A-mEos2 mobilitet blev yderligere kvantificeres ved analyse af middelværdi deplacement (MSD) af de enkelte baner (figur 3B). Statistiske sammenligninger kan gøres ved hjælp af området under MSD kurve (figur 3B). Yderligere analyse af mobilitet udbytter diffusion koefficient distribution af Syntaxin-1A-mEos2, og dette kan evalueres statistisk sammenligning af mobile til immobile befolkningerne (figur 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figur 1 : Generere mEos2-tagged konstruktioner. PFL44S-attB-MCS-w + vektor er lineariseret med BamHI og XbaI. Overlappende Polymerasekædereaktionen (PCR) fragmenter kodning proteiner af interesse (POI) og mEos2, henholdsvis, kan klones, for eksempel, i vivo rekombination i ura3 - gærceller eller Gibson forsamling. Bemærk, at du kan generere Syntaxin-1A-mEos2 transgenet ved vi klonet konstruere flankeret af de endogene Syntaxin-1A promotor og terminatorsekvenser. Den resulterende konstruktion kan efterfølgende blive injiceret i Drosophila embryoner til at skabe en transgene fluelinen udtrykker protein af interesse (POI) smeltet til mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figur 2 : Drosophila larve dissektion og skrå belysning. (A) skemaet viser Drosophila larve dissektion udført på halv-cylindrisk PDMS base. En fileterede larve blev holdt fast af PDMS gel ved brug af minutien pins. (B-C) Larve-PDMS prep var placeret inde i en glas-bund kultur parabol indeholdende Schneiders insekt medium. JOHANNAS mikroskop i en lidt skrå belysning konfiguration blev brugt til at visualisere Syntaxin-1A-mEos2 i de motoriske nerve terminaler. (D-F) En halv-cylindrisk PDMS base med dissekeret Drosophila larve. Larve-PDMS forberedelse var placeret i en billeddannelse fad fyldt med Schneiders medium, og en larve blev afbildet på Super-resolution PALM mikroskop. Skalalinjen, 10 mm. (dette tal er blevet ændret fra14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figur 3 : In vivo sporing af Syntaxin-1A-mEos2 på den præsynaptiske motoriske nerve terminal. (A) A lav opløsning JOHANNAS billede af Syntaxin-1A-mEos2 på en type 1b motoriske nerve terminal. Analyse af photoconversion film afbildet ved 33 Hz genereret sptPALM super-løst intensitet, diffusion koefficient og bane kort. 5,309 individuelle baner blev afbildet over 16.000 billeder film erhvervelse. Skalalinjen, 3 μm. (B-C) Middelværdi deplacement (MSD) af Syntaxin-1A-mEos2 var afbildet fra 6 forskellige motoriske nerve terminaler; areal til MSD kurve (AUC) blev brugt til at kvantificere niveauet af mobilitet. Diffusion koefficient distribution afslører mobile og immobile Syntaxin-1A populationer, der kan kvantificeres som nøgletal for hinanden; ~ 2.400 baner i gennemsnit blev indhentet pr. motoriske nerve terminal (n = 3 larver). Data præsenteres som gennemsnitlige standard fejl af middelværdien. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal at JoVE.com

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Enkelt-molekyle sporing på Drosophila præsynaptiske motoriske Nerve Terminal

Her viser vi hvor enkelt molekyle foto-aktiveret lokalisering mikroskopi kan udføres på den motoriske nerve terminal af en levende Drosophila melanogaster tredje instar larve.

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapacitans Målinger og Ca 2 + Imaging på Single nerveterminaler i Retinal Skiver

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Akut Dissociation af Lamprey Reticulospinal Axoner der muliggør optagelse fra Release Face membran af individuelle funktionelle Præsynaptiske Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantificering Matters: Karakterisering af fænotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optisk Overvågning af Living Nerve Terminal Mærkning i hårsækken lancetformede Endings af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Olfaktoriske Behaviors analyseret ved Computer sporing af<em&gt; Drosophila</em&gt; I en fire-kvadrant olfaktometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverførsel til Schwann-celler i Rodent iskiasnerven ved elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering af Axonal Projeksionsmønsteret af Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...