Name: combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Diffraktion data blev indsamlet på sydøst regionale samarbejdsprojekter adgang Team (SER-kat) 22-ID og 22-BM beamlines på avanceret Photon kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXSA data blev indsamlet på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vil gerne takke personalet på SIBYLS beamline for deres hjælp med remote dataindsamling og forarbejdning. Vi er taknemmelige for den nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjælp fastsættelse af protein domæne grænser. Dette arbejde blev støttet af os National Institute for sundhed murene forskningsprogram; Amerikanske National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR, 146626 til M.C.P). Brug af APS blev støttet af os Department of Energy, Office of Science, Office of grundlæggende energi Sciences under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Brug af avanceret lys kilde (ALS) blev støttet af direktør, Office of Science, Office af energi Grundvidenskab, af det amerikanske Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Yderligere støtte til SIBYLS SAXSA beamline kommer fra National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) og en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vil også gerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritiske læsning af dette manuskript.

1. rekombinante Protein produktion og rensning af Nsa 1
<ol><li>Nsa1 udtryk Plasmid Design og kloning<ol>
<li>Få eller købe S. cerevisiae genomisk DNA.</li>
		<li>PCR forstærke target sekvenser af Nsa1 (Nsa1FL, restkoncentrationer 1-463) og C-terminale afkortet Nsa1 (Nsa1ΔC, restkoncentrationer 1-434) med passende primere ved hjælp af genomisk DNA isoleret fra S. cerevisiae og smeltepunktet af omtrent 60 ° C med en forlængelse tid på 1-2 min. De følgende primere blev bru...

Ved hjælp af denne protokol, blev rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae genereret for strukturelle undersøgelser af både uorganisk kemi og SAXSA. Nsa1 var velopdragen i løsning og krystalliseret i flere krystal formularer. Under optimering af disse krystaller, blev det opdaget, at C-terminus af Nsa1 var følsomme over for protease nedbrydning. Den høje opløsning, ændres krystalform kunne kun være duplikeres med C-terminale trunkering varianter af Nsa1, sandsynligvis fordi den fleksible C-terminus af Nsa1 f...

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner, der udfører vigtige rolle omsætte mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomes er sammensat af to underenheder, der er produceret i en kompleks proces betegnes ribosomet Biogenese1,2,3,4. Eukaryote ribosomet forsamling bygger på ved hjælp af hundredvis af væsentlige ribosomale forsamling faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 knyttet 1) er en eukaryote ribosomet forsamling faktor, der specifikt kræves til produktion af store ribosomale subunit6, og er kendt som WD-repeat der indeholder 74 (WDR74) i højere organismer7. WDR74 har vist sig at være nødvendig for blastocyst dannelse i mus8og WDR74 promotor er ofte muteret i kræft celler9. Men funktion og præcise mekanismer af Nsa1/WDR74 i ribosomet forsamling er stadig stort set ukendt. For at begynde at afsløre rollen, som Nsa1/WDR74 i eukaryote ribosomet modning, blev flere strukturelle analyser udført, herunder røntgenkrystallografi og lille vinkel X-ray spredning (SAXSA)10.
Røntgenkrystallografi, Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, Elektron Mikroskopi og SAXSA er alle vigtige teknikker til at studere makromolekylære struktur. Størrelse, form, tilgængelighed og stabilitet af makromolekyler påvirkninger metoden strukturel biologi som en særlig makromolekyle vil være bedst egnet, men kombinerer flere teknikker gennem en såkaldt "hybrid" tilgang er at blive en i stigende grad gavnlig værktøj11. Især er røntgenkrystallografi og SAXSA kraftfulde og komplementære metoder for Strukturbestemmelse af makromolekyler12.
Krystallografi giver høj opløsning atomic strukturer spænder fra små molekyler til store cellulære maskiner såsom ribosomet, og har ført til mange gennembrud i forståelsen af de biologiske funktion af proteiner og andre makromolekyler13. Derudover udnytter struktur-baseret drug design styrken af krystal strukturer til molekylær docking af beregningsmetoder, tilføje en kritisk dimension til narkotikamisbrug opdagelse og udvikling af14. Trods sit brede anvendelighed er fleksibel og uordnede systemer udfordrende at vurdere krystallografi da crystal pakning kan hæmmes eller electron density maps kan være ufuldstændige eller af dårlig kvalitet. Omvendt er SAXSA en løsning-baseret og lav opløsning strukturelle tilgang i stand til at beskrive fleksible systemer spænder fra uordnede sløjfer og termini til uløseligt uordnede proteiner12,15,16. I betragtning af det er kompatibel med en bred vifte af partikel størrelser12, kan SAXSA arbejde synergistisk med krystallografi at udvide viften af biologiske spørgsmål, der kan adresseres af strukturelle undersøgelser.
Nsa1 er egnet til en hybrid strukturelle tilgang, fordi det indeholder et velstruktureret WD40 domæne efterfulgt af en funktionel, men fleksibel C-terminus, som ikke er indstillet til røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokol til kloning, udtryk og rensning af S. cerevisiae Nsa1 for hybrid Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og SAXSA. Denne protokol kan tilpasses for at studere strukturerne af andre proteiner, der består af en kombination af bestilte og uordnede regioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Cloning of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP2 parallel vector</td>
			<td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td>
			<td></td>
			<td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204508D-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for cloning Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGC CAA AGG CCT 
			ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT 
			GGATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT 
			GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG 
			TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC 
			CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP- NSA1 and various truncations</td>
			<td>Lo et al., 2017</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenomethionine</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-503B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, Dioxane-Free</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>7560-1-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Imidazole, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I6980-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon Affinity Resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV Protease</td>
			<td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td>
			<td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization, Proteolytic Screening</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt Rx</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index&#160; Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG+</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Precipitant Synergy&#160;</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD15-PS-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td>4150-05823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proti-Ace Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES/sodium hydroxide pH 7.5</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-011-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Crystal Caps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cryo Wand</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Foam Dewar</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Puck System</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyMat Sealing Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVEX-m</td>
			<td>JAN Scientific, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito Robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software/Websites</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HKL2000</td>
			<td>Otwinoski and Minor, 1997</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Adams et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>Emsley et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS</td>
			<td>Petoukhov et al., 2012</td>
			<td></td>
			<td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Rambo and Tainer, 2013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&#246;dinger, LLC.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUNCH</td>
			<td>Petoukhov and Svergun, 2005</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRYSOL</td>
			<td>Svergun et al, 1995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al, 2003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Tria et al, 2015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae

Bestemmelse af fuld længde struktur af ribosomet forsamling faktor Nsa1 af Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er udfordrende på grund af den uorden og protease labile C-terminalen af proteinet. Dette manuskript beskriver metoder til at rense rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturel analyse af både uorganisk kemi og SAXSA. Røntgenkrystallografi blev udnyttet til at løse strukturen af Nsa1 velordnet N-terminale WD40 domæne, og derefter SAXSA blev brugt til at løse strukturen af C-terminus af Nsa1 i løsning. Løsning spredning data blev indsamlet fra gulv til loft Nsa1 i løsning. Teoretisk spredning amplituder blev beregnet ud fra den høje opløsning krystalstruktur af domænet WD40, og derefter en kombination af stiv krop og ab initio modellering afslørede C-terminus af Nsa1. Gennem denne hybrid tilgang blev hele proteinet kvaternære struktur rekonstrueret. De metoder, der præsenteres her bør gælde generelt for hybrid Strukturbestemmelse af andre proteiner består af en blanding af strukturerede og ustrukturerede domæner.

Nsa1 var PCR forstærket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor, der indeholder en N-terminale 6 x-histidin affinitet tag efterfulgt af MBP og en TEV protease site. Nsa1 blev omdannet til E. coli BL21(DE3) celler og høje udbytter af protein udtryk blev opnået efter induktion med IPTG og vækst ved 25 ° C natten over (figur 1A). Nsa1 var affinitet renset på immobiliserede kobolt affinitet harpiks, efterfulgt af MBP kavale...

Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Denne metode beskriver kloning, udtryk og oprensning af rekombinante Nsa1 for Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og små-vinkel X-ray spredning (SAXSA), og er gældende for hybrid strukturel analyse af andre proteiner der indeholder begge bestilt og uordnede domæner.

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-matche vaskemiddel i små-Angle Neutron Scattering eksperimenter for membran Protein strukturel analyse og Ab Initio modellering

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang af Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilitet af enkeltmolekyler og klynger af tovejs kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae-celler

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...