Name: combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Diffraksjon dataene ble samlet på Sørøst regionalt samarbeid tilgang Team (SER-CAT) 22-ID og 22-BM beamlines på Avansert Foton kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXS dataene ble samlet inn på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi ønsker å takke ansatte på SIBYLS beamline for deres hjelp med eksterne innsamling og prosessering. Vi er takknemlige til National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjelp avgjøre domenegrenser protein. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institute for Health Intramural forskningsprogram; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de kanadiske instituttene of Health Research (CIHR, 146626 til M.C.P). Bruk av APS ble støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office for energi basalfag under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Bruk av avansert lys kilde (ALS) ble støttet av direktør, Office of Science, Office for energi basalfag, av US Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Ekstra støtte for SIBYLS SAXS beamline kommer fra National Institute of Health prosjektet MINOS (R01GM105404) og et avansert instrumentering Grant S10OD018483. Vi vil også gjerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritisk lesning av dette manuskriptet.

1. rekombinant Protein produksjon og rensing av Nsa 1
<ol><li>Nsa1 uttrykk plasmider Design og kloning<ol>
<li>Få eller kjøpe S. cerevisiae genomisk DNA.</li>
		<li>PCR forsterke målet sekvenser av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) og C-terminalen avkuttet Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med riktig primer bruker genomisk DNA isolert fra S. cerevisiae og en Smeltetemperaturen for ca 60 ° C med en utvidelse tid på 1-2 min. Følgende primerne ble brukt til å forsterke Nsa1: SC_Nsa1_...

Bruker denne protokollen, ble rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae generert for strukturelle studier både Røntgenkrystallografi og SAXS. Nsa1 var godt opptrådt i løsningen og krystallisert i flere krystall skjemaer. Under optimalisering av disse krystallene, ble det oppdaget at C-terminus av Nsa1 var følsom for protease degradering. Høy oppløsning, orthorhombic krystall skjemaet kunne bare dupliseres med C-terminalen trunkering varianter av Nsa1, sannsynligvis fordi fleksibel C-terminus av Nsa1 forhindret k...

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner som utfører den viktige rollen oversette mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomer består av to underenheter som produseres i en kompleks prosess kalt ribosom, biogenesis,1,,2,,3,,4. Eukaryote ribosom montering avhengig ved hjelp av hundrevis av viktige ribosomal montering faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tilknyttet 1) er en eukaryote ribosom montering faktor som er spesielt nødvendig for produksjon av store ribosomal delenhet6, og er kjent som WD-gjenta inneholder 74 (WDR74) i høyere organismer7. WDR74 har vist seg å være nødvendig for blastocysten formasjonen i mus8og WDR74 selskapet er ofte mutert i kreft celler9. Funksjonen og presis mekanismer for Nsa1/WDR74 i ribosom samling er imidlertid fortsatt hovedsakelig ubekjent. For å begynne å avdekke rollen som Nsa1/WDR74 under eukaryote ribosom modning, ble flere strukturelle analyser utført, inkludert Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS)10.
Røntgenkrystallografi, kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi, elektronmikroskop og SAXS er alle viktige teknikker for å studere macromolecular struktur. Størrelse, form, tilgjengelighet og stabilitet av makromolekyler påvirkninger metoden strukturell biologi som en bestemt Makromolekyl vil være best egnet, men kombinerer flere teknikker gjennom en såkalt "hybrid" tilnærming blir en stadig verktøy11. Spesielt er Røntgenkrystallografi og SAXS kraftig og utfyllende metoder for strukturelle besluttsomhet makromolekyler12.
Krystallografi gir høy oppløsning atomic strukturer spenner fra små molekyler til store cellulære maskiner som ribosomet, og har ført til mange gjennombrudd i forståelsen av biologiske funksjoner av proteiner og andre makromolekyler13. Videre utnytter strukturen-baserte narkotika design kraften i crystal strukturer for molekylær dokking ved beregningsorientert metoder, legge en kritisk dimensjon til narkotika og utvikling14. Til tross for anvendelse sin brede er fleksible og uordnede systemer utfordrende å vurdere krystallografi siden krystall pakking kan bli hindret eller electron tetthet kart kan være ufullstendig eller av dårlig kvalitet. Derimot er SAXS en løsning-baserte og lav strukturelle tilnærming kan beskrive fleksibel systemer spenner fra uordnede looper og termini egentlig uordnede proteiner12,15,16. Vurderer den er kompatibel med et bredt spekter av partikkel størrelser12, kan SAXS arbeide synergi med krystallografi å utvide utvalget av biologisk spørsmål som kan løses av strukturelle studier.
Nsa1 er egnet for en hybrid strukturelle tilnærming fordi den inneholder en velstrukturert WD40 domenet etterfulgt av en funksjonell, men fleksible C-terminus som ikke er mottakelig for Røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokoll for kloning, uttrykk og rensing av S. cerevisiae Nsa1 for hybrid strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og SAXS. Denne protokollen kan tilpasses for å studere strukturer av andre proteiner som består av en kombinasjon av bestilte og uordnede.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Cloning of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP2 parallel vector</td>
			<td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td>
			<td></td>
			<td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204508D-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for cloning Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGC CAA AGG CCT 
			ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT 
			GGATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT 
			GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG 
			TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC 
			CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP- NSA1 and various truncations</td>
			<td>Lo et al., 2017</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenomethionine</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-503B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, Dioxane-Free</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>7560-1-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Imidazole, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I6980-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon Affinity Resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV Protease</td>
			<td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td>
			<td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization, Proteolytic Screening</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt Rx</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index&#160; Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG+</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Precipitant Synergy&#160;</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD15-PS-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td>4150-05823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proti-Ace Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES/sodium hydroxide pH 7.5</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-011-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Crystal Caps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cryo Wand</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Foam Dewar</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Puck System</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyMat Sealing Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVEX-m</td>
			<td>JAN Scientific, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito Robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software/Websites</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HKL2000</td>
			<td>Otwinoski and Minor, 1997</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Adams et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>Emsley et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS</td>
			<td>Petoukhov et al., 2012</td>
			<td></td>
			<td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Rambo and Tainer, 2013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&#246;dinger, LLC.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUNCH</td>
			<td>Petoukhov and Svergun, 2005</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRYSOL</td>
			<td>Svergun et al, 1995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al, 2003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Tria et al, 2015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae

Fastsettelse av full lengde ribosom montering faktor Nsa1 fra Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er utfordrende på grunn av den uordnede og protease labil C-terminus av protein. Dette manuskriptet beskriver metodene for å rense rekombinant Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturell analyse av både Røntgenkrystallografi og SAXS. Røntgenkrystallografi ble benyttet for å løse strukturen i velordnet N-terminal WD40 domenet Nsa1, og deretter SAXS ble brukt til å løse strukturen i C-terminus av Nsa1 i løsningen. Løsning spredning data var samlet inn fra full lengde Nsa1 i løsningen. De teoretiske spredning amplituder ble beregnet fra den høyoppløselige krystallstruktur WD40 domenet, og deretter en kombinasjon av rigid kropp og ab initio modellering avslørt C-terminus av Nsa1. Gjennom denne hybrid rekonstruert kvartær strukturen av hele protein. Metodene presenteres her skal generelt gjelder for hybrid strukturelle fastsettelse av andre proteiner som består av en blanding av strukturert og ustrukturert domener.

Nsa1 var PCR forsterket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor inneholder en N-terminal 6 x-histidin affinitet kode etterfulgt av MBP og en TEV protease nettsted. Nsa1 ble forvandlet til E. coli BL21(DE3) celler og høy avkastning av protein uttrykk ble innhentet etter induksjon med IPTG og vekst ved 25 ° C over natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renset på immobilisert kobolt affinitet harpiks, etterfulgt av MBP spaltin...

Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Denne metoden beskriver kloning, uttrykk og rensing av rekombinant Nsa1 for strukturelle vilje av Røntgenkrystallografi og liten vinkel X-ray spredning (SAXS) og gjelder for hybrid strukturell analyse av andre proteiner som inneholder begge bestilte og uordnede domener.

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og Ab Initio modellering

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriedatasamling med fast mål ved diamantlyskilde

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilitet av enkeltmolekyler og klynger av toveis Kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae celler

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...