Name: combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa programa nacional; E.U. Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 de R. E. S.) e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR, 146626 para M.C.P). Uso de APS foi apoiado pelo departamento de energia, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas sob contrato n º W-31-109-Eng-38. Uso da fonte de luz avançado (ALS) foi apoiado pelo Director, Office of Science, escritório de energia ciências básicas, o departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231. Suporte adicional para a trajetória de SIBILAS SAXS vem do Instituto Nacional de saúde do projeto MINOS (R01GM105404) e um high-end instrumentação Grant S10OD018483. Também gostaríamos de agradecer a Andrea Moon e Dr. Sara Andres por sua leitura crítica deste manuscrito.

1. recombinação da proteína produção e purificação da Nsa 1
<ol><li>Design de plasmídeo de expressão Nsa1 e clonagem<ol>
<li>Obter ou comprar o DNA genômico de S. cerevisiae .</li>
		<li>PCR amplificar sequências alvo de Nsa1 (Nsa1FL, resíduos 1-463) e C-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, resíduos 1-434) com primers apropriados usando o DNA genômico de isolados de S. cerevisiae e uma temperatura de fusão aproximadamente 60 ° C com um tempo de extensão de 1-2 min. O...

Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Ns...

Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota que especificamente necessária para a produção do grande subunidade ribossomal6, e é conhecido como WD-repetição contendo 74 (WDR74) no maior organismos7. WDR74 tem demonstrado ser necessário para a formação de blastocistos em ratos8e o promotor de WDR74 é frequentemente uma mutação em células de câncer9. No entanto, a função e mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 no assembly do Ribossoma ainda são em grande parte desconhecidos. Para começar a descobrir o papel de Nsa1/WDR74 durante o amadurecimento do Ribossoma eucariota, realizaram-se várias análises estruturais, incluindo cristalografia de raios x e pequeno ângulo de espalhamento (SAXS) de raio-x10.
Cristalografia de raios x, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia eletrônica e SAXS são todos importantes técnicas para estudar a estrutura macromolecular. Tamanho, forma, disponibilidade e estabilidade das influências de macromoléculas, o método de biologia estrutural, para o qual uma macromolécula particular será melhor adequado, no entanto, combinar várias técnicas através de uma abordagem so-called "híbrido" está se tornando um ferramenta cada vez mais benéfico11. Em particular, cristalografia de raios x e SAXS são complementares e poderosos métodos para determinação estrutural de macromoléculas12.
Cristalografia fornece estruturas atômicas de alta resolução, variando de pequenas moléculas a grande maquinaria celular, tais como o ribossoma e levou a inúmeros avanços na compreensão das funções biológicas das proteínas e outros macromoléculas13. Além disso, o design de drogas baseado em estrutura aproveita o poder da estruturas de cristal para encaixe molecular por métodos computacionais, acrescentando uma dimensão crítica a droga descoberta e desenvolvimento de14. Apesar de sua ampla aplicabilidade, sistemas flexíveis e desordenados são difíceis de avaliar por cristalografia, desde que a embalagem de cristal pode ser prejudicada ou mapas de densidade de elétrons podem ser incompletos ou de má qualidade. Por outro lado, SAXS é uma abordagem estrutural baseada em solução e baixa resolução capaz de descrever sistemas flexíveis, variando de loops desordenados e termini a proteínas intrinsecamente desordenado12,15,16. Considerando que é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas12, SAXS pode trabalhar em sinergia com cristalografia para ampliar o leque de questões biológicas que podem ser abordados pelos estudos estruturais.
Nsa1 é apropriado para uma abordagem estrutural de híbrido, porque ele contém um domínio WD40 bem estruturado, seguido de um C-terminal funcional, mas flexível que não é passível de métodos de cristalografia de raios x. A seguir é um protocolo para a clonagem, expressão e purificação de S. cerevisiae Nsa1 para determinação estrutural híbrido por cristalografia de raios x e SAXS. Este protocolo pode ser adaptado para estudar as estruturas de outras proteínas que são compostas por uma combinação de regiões ordenadas e desordenadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Cloning of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP2 parallel vector</td>
			<td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td>
			<td></td>
			<td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204508D-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for cloning Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGC CAA AGG CCT 
			ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT 
			GGATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT 
			GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG 
			TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC 
			CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP- NSA1 and various truncations</td>
			<td>Lo et al., 2017</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenomethionine</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-503B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, Dioxane-Free</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>7560-1-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Imidazole, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I6980-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon Affinity Resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV Protease</td>
			<td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td>
			<td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization, Proteolytic Screening</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt Rx</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index&#160; Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG+</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Precipitant Synergy&#160;</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD15-PS-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td>4150-05823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proti-Ace Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES/sodium hydroxide pH 7.5</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-011-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Crystal Caps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cryo Wand</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Foam Dewar</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Puck System</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyMat Sealing Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVEX-m</td>
			<td>JAN Scientific, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito Robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software/Websites</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HKL2000</td>
			<td>Otwinoski and Minor, 1997</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Adams et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>Emsley et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS</td>
			<td>Petoukhov et al., 2012</td>
			<td></td>
			<td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Rambo and Tainer, 2013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&#246;dinger, LLC.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUNCH</td>
			<td>Petoukhov and Svergun, 2005</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRYSOL</td>
			<td>Svergun et al, 1995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al, 2003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Tria et al, 2015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae

Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.

Nsa1 foi PCR amplificados de DNA genômico de S. cerevisiae e subcloned em um vetor que contém uma marca de afinidade de 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP e um site de protease TEV. Nsa1 transformou-se em células de Escherichia coli BL21(DE3) e rendimentos elevados da expressão da proteína foram obtidos após indução com IPTG e crescimento a 25 ° C durante a noite (figura 1A). Nsa1 foi afinidade-purified na resina de afinidade d...

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Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

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Bioquímica

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

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Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...