Name: combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Дифракция данные были собраны на юго-востоке региональных совместных доступ команды (SER-CAT) 22-ID и 22-BM излучение в Advanced Фотон источник (APS), Аргоннской национальной лаборатории. ЛУЧЕЙ данные были собраны на СИБИЛЛЫ излучение на заранее источника света (ALS), Лоуренса Беркли национальной лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников на излучение СИБИЛЛЫ за их помощь с удаленного сбора и обработки информации. Мы признательны исследований спектрометрии массы национального института окружающей среды медицинских наук (NIEHS) и группа поддержки за помощь в определении границ домена протеина. Эта работа получила поддержку от нас Национальный институт здравоохранения интрамуральных исследований программа; США Национальный институт наук санитарного состояния окружающей среды (NIEHS) (Зия ES103247 на р. е. с.) и канадский институты медицинских исследований (КНИИЗ, 146626 до M.C.P). Использование APS было поддержано Министерством энергетики США, управление науки, отделение фундаментальных наук энергии под контракт № W-31-109-Рус-38. Использование передовых источника света (ALS) было поддержано директор, управление науки, управление основные энергии наук, Министерство энергетики США под контракт № ДЕ AC02-05CH11231. Дополнительная поддержка для лучей СИБИЛЛЫ излучение происходит от национального института здравоохранения Минос (R01GM105404) и проекта элитного инструментария Грант S10OD018483. Мы также хотели бы поблагодарить Андреа Луна и доктор Сара Андрес за их критическое прочтение этой рукописи.

1. Рекомбинантный белок производства и очистки НГБ 1
<ol><li>Nsa1 выражение плазмида дизайн и клонирование<ol>
<li>Получить или приобрести S. cerevisiae геномной ДНК.</li>
		<li>ПЦР усилить целевой последовательности Nsa1 (Nsa1FL, остатки 1-463) и C-терминал усечена Nsa1 (Nsa1ΔC, остатки 1-434) с соответст...

Используя этот протокол, рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae был сгенерирован для структурных исследований рентгеноструктурного анализа и лучей. Nsa1 было хорошо себя вели в растворе и кристаллизуется в нескольких формах кристалл. В процессе оптимизации этих кристаллов было обнаружено, ч...

Рибосомы являются большие рибонуклеопротеида машины, которые осуществляют важную роль перевода мРНК на белки во всех живых клетках. Рибосомы состоят из двух субъединиц, которые производятся в рамках сложного процесса, называют рибосома биогенеза1,2,3,4. Эукариотические рибосомы Ассамблея полагается на помощь сотни основных рибосомных Ассамблеи факторов2,3,5. Nsa1 (Nop7 связанные 1) является фактором Ассамблеи Эукариотические рибосомы, что конкретно требуется для производства большой субъединицы рибосомальной6, и это известный как WD-повторяю, содержащий 74 (WDR74) в высших организмов7. WDR74 было показано, для формирования бластоцисты в мышей8и промоутер WDR74 часто мутирует в раковых клетках9. Однако функция и точных механизмов Nsa1/WDR74 в Ассамблее рибосомы по-прежнему в основном неизвестны. Чтобы начать раскрыть роль Nsa1/WDR74 во время созревания Эукариотические рибосомы, несколько структурные анализы, включая рентгеноструктурного анализа и малоуглового рентгеновского рассеяния (лучей)10.
Рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии, электронной микроскопии и лучей являются все важные методы для изучения макромолекулярной структуры. Размер, форма, доступность и стабильность макромолекул воздействий структурной биологии метод, для которого особенно макромолекулы будет лучше подходит, однако сочетая несколько методов через так называемый «гибридный» подход становится 11все более полезным инструментом. В частности рентгеноструктурного анализа и лучей являются мощными и взаимодополняющие методы структурной определения макромолекул12.
Кристаллография обеспечивает высоким разрешением атомных структур, начиная от маленьких молекул до больших клеточными как рибосомы и привела к многочисленным прорывам в понимании биологических функций белков и других 13макромолекул. Кроме того на основе структуры наркотиков дизайн использует власть кристаллических структур молекулярного стыковки, вычислительные методы, добавление критическое измерение наркотиков открытие и развитие14. Несмотря на его широкую применимость гибкие и неупорядоченных систем сложно оценить, кристаллография, так как кристалл упаковка может быть затруднено или карт плотности электронов может быть неполным или низкого качества. И наоборот лучей является на основе решения и разрешением структурный подход, способный описания гибких систем, начиная от неупорядоченных петель и Термини неразрывно неупорядоченных белки12,,1516. Учитывая, что это совместимо с широкий спектр частиц размерами12, лучей может работать синергически с кристаллографии расширить спектр биологических вопросов, которые могут быть рассмотрены структурные исследования.
Nsa1 подходит для гибридных структурный подход, потому что она содержит структурированный WD40 домена следуют функциональный, но гибкие C-конечная, которая не поддается методы рентгеноструктурного анализа. Ниже — это протокол для клонирования, выражения и очистки Nsa1 S. cerevisiae для гибридных структурные определения рентгеноструктурного анализа и лучей. Этот протокол может быть адаптирована для изучения структур других белков, которые состоят из комбинации упорядоченной и неупорядоченной регионов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Cloning of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP2 parallel vector</td>
			<td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td>
			<td></td>
			<td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204508D-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for cloning Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGC CAA AGG CCT 
			ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT 
			GGATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT 
			GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG 
			TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC 
			CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP- NSA1 and various truncations</td>
			<td>Lo et al., 2017</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenomethionine</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-503B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, Dioxane-Free</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>7560-1-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Imidazole, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I6980-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon Affinity Resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV Protease</td>
			<td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td>
			<td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization, Proteolytic Screening</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt Rx</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index&#160; Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG+</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Precipitant Synergy&#160;</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD15-PS-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td>4150-05823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proti-Ace Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES/sodium hydroxide pH 7.5</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-011-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Crystal Caps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cryo Wand</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Foam Dewar</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Puck System</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyMat Sealing Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVEX-m</td>
			<td>JAN Scientific, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito Robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software/Websites</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HKL2000</td>
			<td>Otwinoski and Minor, 1997</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Adams et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>Emsley et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS</td>
			<td>Petoukhov et al., 2012</td>
			<td></td>
			<td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Rambo and Tainer, 2013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&#246;dinger, LLC.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUNCH</td>
			<td>Petoukhov and Svergun, 2005</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRYSOL</td>
			<td>Svergun et al, 1995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al, 2003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Tria et al, 2015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae

Определение структуры полнометражного рибосома Ассамблеи фактора Nsa1 от Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) является сложной задачей из-за неупорядоченных и протеазы лабильной C-конечная белка. Эта рукопись описывает методы для очистки рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae для структурного анализа рентгеноструктурного анализа и лучей. Рентгеноструктурного анализа был использован для решения структуры упорядоченный WD40 N-концевой домен Nsa1, а затем лучей был использован для устранения структуры C-конечная Nsa1 в растворе. Решение рассеяния данные были собраны из полнометражных Nsa1 в растворе. Теоретические рассеяния амплитуд были рассчитаны с высоким разрешением кристаллической структуре WD40 домена, а затем сочетание твердого тела и ab initio моделирования показала C-конечная Nsa1. Через этот гибридный подход был реконструирован Четвертичная структура всей белка. Представленные здесь методы должны быть общеприменимыми для гибридных структурные определения других белков, состоящий из смеси структурированных и неструктурированных доменов.

Nsa1 был ПЦР усиливается от S. cerevisiae геномной ДНК и subcloned в вектор, содержащий тег сродство 6 x гистидина N-терминальный следуют MBP и сайт ТэВ протеазы. Nsa1 был преобразован в клетках E. coli BL21(DE3) и высокие урожаи экспрессии белков были получены после индукции с IPTG и рос...

Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Этот метод описывает клонирования, выражения и очистки рекомбинантных Nsa1 для определения структурных рентгеноструктурного анализа и малым угол рентгеновского рассеяния (лучей) и применим для гибридных структурный анализ других белков содержащие оба заказал и неупорядоченных доменов.

Сочетая рентгеноструктурного анализа с малоуглового рентгеновского рассеяния для моделирования неструктурированных регионов Nsa1 от S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...