Name: combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Diffraktion data samlades in på southeasten regionala samarbete tillgång Team (SER-CAT) 22-ID och 22-BM linjer på Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. SAXS data samlades in på den SIBYLS beamline på förhand ljus källa (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vill tacka Personalen på den SIBYLS beamline för hjälp med remote datainsamling och bearbetning. Vi är tacksamma för nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry forskning och stödgruppen för hjälp med att avgöra protein domän gränserna. Detta arbete fick stöd av oss nationella institutet för hälsa intramurala forskningsprogrammet; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 till R. E. S.) och kanadensiska institut för hälsoforskning (CIHR, 146626 till M.C.P). Användning av APS stöddes av oss Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38. Användning av avancerade ljus källa (ALS) stöddes av direktören, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231. Ytterligare stöd för den SIBYLS SAXS beamline kommer från National Institute of Health projektet MINOS (R01GM105404) och en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vill också tacka Andrea Moon och Dr Sara Andres för deras kritisk läsning av detta manuskript.

1. rekombinant proteinproduktion och rening av Nsa 1
<ol><li>Nsa1 uttryck Plasmid Design och kloning<ol>
<li>Få eller köpa S. cerevisiae genomiskt DNA.</li>
		<li>PCR förstärker de mål sekvenserna av Nsa1 (Nsa1FL, rester 1-463) och C-terminal trunkeras Nsa1 (Nsa1ΔC, rester 1-434) med lämplig grundfärg med genomiskt DNA isolerade från S. cerevisiae och en smälttemperatur cirka 60 ° C med en förlängning på 1-2 min. Följande grundfärger användes för att förstärka...

Användning av detta protokoll, genererades rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturella studier av både röntgenkristallografi och SAXS. Nsa1 var skötsam i lösning och kristalliserade i flera crystal former. Under optimering av dessa kristaller upptäckte att C-terminus av Nsa1 var känsliga för proteas nedbrytning. Den höga upplösningen, ortorombiskt kristallform kunde endast dupliceras med C-terminal trunkering varianter av Nsa1, sannolikt eftersom flexibla C-terminus av Nsa1 hindrade crystal ...

Ribosomer är stora ribonukleoprotein maskiner som utför viktiga roll att översätta mRNA till proteiner i alla levande celler. Ribosomerna består av två subenheter som produceras i en komplex process som kallas ribosom biogenes1,2,3,4. Eukaryota Ribosomen församling är beroende av hjälp av hundratals väsentliga ribosomal församlingen faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 tillhörande 1) är en faktor av eukaryota Ribosomen-församlingen som särskilt krävs för produktionen av den stora ribosomal subunit6, och är känd som WD-repeat som innehåller 74 (WDR74) i högre organismer7. WDR74 har visat sig krävas för blastocyst bildandet i möss8och WDR74 arrangören är ofta muterad i cancer celler9. Funktion och exakta mekanismer av Nsa1/WDR74 i Ribosomen församling är dock fortfarande till stor del okända. Till att börja med att avslöja Nsa1/WDR74 roll under eukaryota Ribosomen mognad utfördes flera strukturella analyser, inklusive röntgenkristallografi och små angle X-ray scattering (SAXS)10.
Röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, elektronmikroskopi och SAXS finns alla viktiga tekniker för att studera makromolekylära struktur. Storlek, form, tillgänglighet och stabilitet av makromolekyler influenser strukturbiologi metoden som en särskild makromolekyl blir bäst lämpade, men kombinerar flera tekniker genom en s.k. ”hybrid” strategi blir en allt mer fördelaktigt verktyg11. Röntgenkristallografi och SAXS är särskilt kraftfull och kompletterande metoder för strukturella bestämning av makromolekyler12.
Kristallografi ger högupplösta atomära strukturer alltifrån små molekyler till stora cellulära maskineriet såsom Ribosomen, och har lett till många genombrott i förståelsen av de biologiska funktionerna av proteiner och andra makromolekyler13. Dessutom utnyttjar strukturbaserad design kraften i kristallen strukturerar för molekylär dockning av beräkningsmetoder, lägga till en kritisk dimension i drug discovery och utveckling14. Trots dess breda tillämplighet är flexibel och oordnade system utmanande att bedöma av kristallografi sedan crystal packning kan hindras eller electron densitet kartor kan vara ofullständig eller av dålig kvalitet. Omvänt, SAXS är en lösning-baserade och lågupplösta strukturell strategi kan beskriva flexibla system alltifrån oordnade loopar och termini till egensäkra oordnade proteiner12,15,16. Med tanke på den är kompatibel med ett brett spektrum av partikel storlekar12, kan SAXS arbeta synergistiskt med kristallografi att öka utbudet av biologiska frågor som kan lösas av strukturella studier.
Nsa1 är lämplig för en hybrid strukturell strategi eftersom det innehåller en väl strukturerad WD40 domän följt av en funktionell, men flexibel C-terminus som inte är mottagliga för röntgenkristallografi metoder. Följande är ett protokoll för kloning, uttryck och rening av S. cerevisiae Nsa1 för hybrid strukturella bestämning av röntgenkristallografi och SAXS. Detta protokoll kan anpassas för att studera strukturerna av andra proteiner som består av en kombination av beställda och störda områden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Cloning of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP2 parallel vector</td>
			<td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td>
			<td></td>
			<td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>204508D-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for cloning Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>CGC CAA AGG CCT 
			ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT 
			GGATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_FLRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT 
			GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC 
			AGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG 
			TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC 
			CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMBP- NSA1 and various truncations</td>
			<td>Lo et al., 2017</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenomethionine</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-503B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, Dioxane-Free</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>7560-1-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Imidazole, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I6980-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talon Affinity Resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV Protease</td>
			<td>Prepared by NIEHS Protein Expression Core</td>
			<td>Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>456-8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization, Proteolytic Screening</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Screen 2</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salt Rx</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index&#160; Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG/Ion Screen</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG+</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Precipitant Synergy&#160;</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD15-PS-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td>4150-05823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proti-Ace Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES/sodium hydroxide pH 7.5</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-011-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate tribasic</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed Bead Kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Crystal Caps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cryo Wand</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Foam Dewar</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Puck System</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>M-CP-111-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyMat Sealing Mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVEX-m</td>
			<td>JAN Scientific, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito Robot</td>
			<td>TTP Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software/Websites</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HKL2000</td>
			<td>Otwinoski and Minor, 1997</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td>Adams et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td>Emsley et al., 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS</td>
			<td>Petoukhov et al., 2012</td>
			<td></td>
			<td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Rambo and Tainer, 2013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schr&#246;dinger, LLC.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUNCH</td>
			<td>Petoukhov and Svergun, 2005</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRYSOL</td>
			<td>Svergun et al, 1995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al, 2003</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EOM</td>
			<td>Tria et al, 2015</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining x-ray crystallography with small angle x-ray scattering to model unstructured regions of nsa1 from s. cerevisiae

Bestämning av Ribosomen församlingen faktor Nsa1 från Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) fullängds struktur är utmanande på grund av den oordnade och proteashämmare labila C-terminus av protein. Detta manuskript beskrivs metoder för att rena rekombinant Nsa1 från S. cerevisiae för strukturanalys av både röntgenkristallografi och SAXS. Röntgenkristallografi utnyttjades för att lösa strukturen av Nsa1 välordnad N-terminala WD40 domän, och sedan SAXS användes för att lösa C-terminus av Nsa1 struktur i lösning. Lösning scattering data samlades in från fullängds Nsa1 i lösning. De teoretiska scattering amplituderna beräknades från högupplösta kristallstrukturen i WD40 domänen, och sedan en kombination av stel kropp och rättsverkan modellering visade C-terminus av Nsa1. Genom denna hybrid strategi rekonstruerades den Kvartära strukturen av hela proteinet. De metoder som presenteras här bör vara allmänt tillämpliga för hybrid strukturella bestämning av andra proteiner som består av en blandning av strukturerad och ostrukturerad domäner.

Nsa1 var PCR amplifierats från S. cerevisiae genomiskt DNA och subcloned i en vektor innehållande en N-terminal 6 x-histidin affinitet tagg följt av MBP och en TEV proteas webbplats. Nsa1 förvandlades till E. coli BL21(DE3) celler och hög avkastning i proteinuttryck erhölls efter induktion med IPTG och tillväxt vid 25 ° C över natten (figur 1A). Nsa1 var affinitet-renat på immobiliserade kobolt affinitet harts, följt av MBP klyvni...

Watch this Scientific Journal Video about Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae at JoVE.com

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Denna metod beskriver kloning, uttryck och rening av rekombinant Nsa1 för strukturella bestämning av röntgenkristallografi och small-angle X-ray scattering (SAXS), och är tillämplig för hybrid strukturell analys av andra proteiner som innehåller både beställde och andningsstörningar domäner.

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-matchande tvättmedel i liten vinkel Neutron Scattering experiment för membran Protein strukturell analys och Ab Initio modellering

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motilitet av enskilda molekyler och kluster av dubbelriktad kinesin-5 Cin8 renad från S. cerevisiae-celler

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...