Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

وأيد هذا البحث [جزئيا] "برنامج البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و "ديمايو فرانكو" لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.

وأجريت جميع العمليات كجزء من العمل العادي لمرفق "نيس تدق الماوس خارج الأساسية". وأبقى جميع الفئران في 12:12 دورة ح الضوء: الظلام، وكانت تتغذى على نظام غذائي من المعاهد الوطنية للصحة-31 والمياه متواصلة ad. جميع التجارب التي أجريت وفقا للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة للوطنية معهد لعلوم الص...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف ...

لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.

علاج خط الخلية كأثر عشوائي، استخدم نموذج خطي آثار مختلطة لتحليل البيانات في البرنامج (مثل محركات أقراص SAS (الإصدار 9.2)). تحليل كل الخاضعة لعدد الأجنة المنقولة وخط الخلية. التحليل الثاني يسيطر أيضا على عدد من الجراء التي نجت.
لهذه الدراسة، ك?...

Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا البطانية لعلاج نقص التروية Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...