Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Denne forskning blev støttet [del] af murene forskningsprogrammet af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Særlig tak til Shyamal Peddada for statistisk analyse. Vi vil også gerne takke Humphrey Yao, Gary fugl og Yuki Arao for gennemgang af dette manuskript og Franco DeMayo for hans fortsatte støtte og rådgivning.

Alle operationer blev udført som en del af den normale drift af NIEHS Knock Out mus Core facilitet. Alle mus blev holdt på en 12:12 h lys: mørke cyklus, og var affodre en kost af NIH-31 og vand ad libitum. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Animal Care og brug Udvalget af National Institute of miljømæssige sundhed Sciences.
1. animalsk forberedelse
<ol><li>Racen donor mus, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J hunmus på 8-10 uger af alder naturligvis til B6 (Cg)-Tyr < c-...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Det har længe været tænkt, at enhver forstyrrelse af ICM kunne føre til dødelighed, faktisk nuværende blastocyst mikroinjektion protokoller stadig advare denne12,13. Her har vi vist er der mikroinjektion gennem ICM er ikke skadeligt for fosteret, og øger udbyttet af kimærer.
Den nøjagtige mekanisme for denne effekt er ikke blevet identificeret. Den mekanisk afbrydelse af ICM, og den ledsagende hypoblast, bør imidlertid øge f...

I næsten 25 år, har oprettelsen af genetisk målrettede mus været en langsommelig proces, ofte hæmmet af en flaskehals på stadiet blastocyster ES celle mikroinjektion for generation af kønscelleoverførsel sender kimærer. De seneste fremskridt, herunder CRISPR/Cas91,2 målretning i ES-celler og høj overførselshastighed ES celle generation konsortier som KOMP, har forbedret generation/tilgængelighed af genetisk modificerede celler, ES. Generation af kønscelleoverførsel kimærer er imidlertid fortsat en flaskehals i at skabe genetisk modificerede mus fra disse ES celler3,4. Høj overførselshastighed ES celle generation projekter har været plaget af høj variabilitet i ES celle kvalitet, som er afgørende for vellykket skabelse af kønscelleoverførsel kimærer. Derudover er nogle af de almindeligt udnyttede ES cellelinjer kendt for høj aneuploidi og vanskelig produktion af kønscelleoverførsel kompetente kimærer5.
Mange metoder er blevet udviklet for at skabe mus med enten en højere chimera, eller helt ES celle afledte mus6,7,8,9,10. Mens hver af disse systemer har sine egne meritter, har de også deres svagheder. Generation af tetraploide kimærer, mens generere 100% ES celle afledte mus, er ineffektive, og er generelt begrænset til outbred linjerne 5,6. Nyere metoder til indsprøjtning morula kan give høj procentdel kimærer, nærmer sig 100%, men generelt kræver betydelige yderligere udstyr (lasere eller piezos) og uddannelse10,11. I laboratorier, hvor disse teknikker er allerede på plads, kan denne nye metode ikke være nødvendigt.
Denne undersøgelse mål var at finde en metode, der bruger almindelige teknikker og let tilgængelige udstyr til at øge hastigheden af chimera generation, øge chancen for kønscelleoverførsel transmission af den mutante allel at etablere efterfølgende mus koloni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

I et forsøg på at øge effektiviteten i skabelsen af genmodificerede mus via ES celle metoder, præsenterer vi en tilpasning til de nuværende blastocyst injektion protokol. Vi rapporterer her, en enkel rotation af embryo og injektion gennem Trans-indre cellemasse (TICM) steg andelen af kimære Mus fra 31% til 50%, uden ekstra udstyr eller yderligere specialuddannelse. 26 forskellige indavlede kloner, og 35 samlede kloner blev injiceret over en periode på 9 måneder. Der var ingen signifikant forskel i enten graviditetsrate eller genfindingsprocenten for embryoner mellem traditionelle injektionsteknik og TICM. Derfor uden større ændring i indsprøjtningssystem processen og en simpel positionering af blastocyst og indsprøjte gennem ICM, kan frigive ES-celler i blastocoel hulrum potentielt forbedre mængden kimære produktion og efterfølgende kønscelleoverførsel transmission.

Behandling af celle-linje som de tilfældige effekt, blev en blandet effekter lineær model brugt til at analysere dataene i software (f.eks. SAS (version 9.2)). Hver analyse kontrolleres for antallet af embryoner overført og cellelinie. Den anden analyse også kontrolleret for antallet af unger, der overlevede.
For denne undersøgelse, hvert ES cellelinie og klon blev sprøjtet både med traditionelle og TICM teknikker, veksle...

Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Her præsenterer vi en protokol for at øge chimera produktion uden brug af nyt udstyr. En simpel orientering ændring af embryo til injektion kan øge antallet af embryoner produceret og potentielt reducere tidslinjen til kønscelleoverførsel transmission.

Trans-indre celle masse injektion af stamceller fra embryoner fører til højere kimærisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Brug af LysoTracker at opdage programmeret celledød i Embryoner og Differentiering embryonale stamceller

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...