Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
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Diese Forschung wurde von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [teilweise] unterstützt. Besonderen Dank an Shyamal Peddada für statistische Analysen. Wir wünschen auch Humphrey Yao, Gary Vogel und Yuki Arao zur Überprüfung dieser Handschrift, und Franco DeMayo für seine anhaltende Unterstützung und Beratung bedanken.

Alle Arbeiten erfolgten im Rahmen des normalen Betriebs des NIEHS Knock Out Maus Core Facility. Alle Mäuse blieben auf einem 12:12 h Licht: Dunkel-Zyklus, und waren eine Diät von NIH-31 und Wasser ernähren ad libitum. Alle Versuche wurden im Einklang mit der Animal Care und Gebrauch von dem National Institute of Environmental Health Sciences durchgeführt.
(1) tierische Vorbereitung
<ol><li>Züchten Spender Mäuse, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 8-10 Wochen alt nat...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.
Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und ...

Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas91,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen3,4. Hochdurchsatz-ES Zelle stromerzeugungsprojekte haben durch hohe Variabilität in ES-Zellen-Qualität, die entscheidend für die erfolgreiche Erstellung der Keimbahn Chimären ist geplagt. Darüber hinaus sind einige der häufig verwendeten ES-Zelllinien für hohe Aneuploidie und schwierige Produktion der Keimbahn zuständigen Chimären5bekannt.
Viele Methoden wurden entwickelt für die Erstellung von Mäusen mit entweder eine höhere Chimäre oder komplett ES Zelle abgeleitet Mäuse6,7,8,9,10. Während jedes dieser Systeme seine eigenen Vorzüge hat, haben sie auch ihre Schwächen. Die Generation der tetraploiden Chimären, während generieren 100 % ES Zelle Mäuse, abgeleitet ist ineffizient und in der Regel beschränkt auf fremd-Linien 5,6. Neuere Methoden der Morula Injektion können Ausbeute hohen Prozentsatz Chimären, annähernd 100 %, aber erfordern in der Regel erhebliche zusätzliche Ausrüstung (Laser oder Piezos) und Training10,11. Im Labor, wo diese Techniken bereits vorhanden sind, kann diese neue Methode nicht erforderlich sein.
Ziel dieser Studie war es, eine Methode zu finden, die gängige Techniken und leicht verfügbare Ausrüstung zur Erhöhung der Chimäre-Generation, die Chance der Keimbahn Übertragung des mutierten Allels, die anschließende Maus Kolonie zu erhöhen verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.

Zell-Linie als des random-Effekts zu behandeln, wurde ein lineares Modell gemischte Effekte verwendet, zum Analysieren der Daten in der Software (z.B. SAS (Version 9.2)). Jede Analyse für die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zell-Linie gesteuert. Die zweite Analyse auch für die Anzahl der Welpen, die überlebt gesteuert.
Für diese Studie jedes ES Zelllinie und Klon wurde sowohl mit traditionellen injiziert und TICM ...

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...