Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

מחקר זה נתמך [חלקית] על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה. תודה מיוחדת Shyamal Peddada לשם ניתוח סטטיסטי. אנחנו גם רוצים להודות יאו האמפרי, גארי ציפור, יוקי םינוי לסקירה של כתב היד הזאת, פרנקו דימיו עבור המשך תמיכה וייעוץ שלו.

כל הפעולות נעשו כחלק מההתנהלות הרגילה של המתקן NIEHS לדפוק את העכבר הליבה. כל העכברים הוחזקו 12:12 מחזור אור h: כהה, היו להאכיל דיאטה של NIH-31 ומים ad libitum. כל הניסויים בוצעו בהתאם החיה אכפת והוועדה שימוש של נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה.
1. הכנה בעלי חיים
<ol><li>מתרבים התורם עכבר?...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

זה זמן רב כבר חשבה כי כל הפרעה של ICM יכול להוביל התמותה, למעשה, הנוכחי הבלסטוציסט microinjection פרוטוקולים עדיין מזהירים זה12,13. מה שהראתי כאן זה microinjection דרך ICM אינה פוגעת העובר, והיא מגדילה את היבול של כימרות.
המנגנון המדויק בשביל האפקט הזה לא זוהתה. ע...

במשך קרוב ל-25 שנים, הקמת יישוב גנטית עכברים כבר תהליך איטי, לעיתים קרובות הקשו על ידי צוואר בקבוק בשלב microinjection תא blastocysts ES לדור של germline משדר כימרות. הפיתוחים האחרונים, כולל1,CRISPR/Cas92 פילוח תאים ES, תפוקה גבוהה ES תא דור מהמגזר כמו komp ב, השתפרו הדור/הזמינות של תאים ES מהונדסים. עם זאת, הדור של germline כימרות נשאר צוואר בקבוק ביצירת עכברים מהונדסים אלה ES תאים3,4. תפוקה גבוהה ES תא דור פרויקטים שייסרו על ידי השתנות גבוהה באיכות תא ES, אשר הוא קריטי עבור יצירה מוצלחת של germline כימרות. בנוסף, חלק מהשורות תא ES שימוש בדרך כלל ידועים הגבוהה אנאפלואידיה וייצור קשה germline כימרות המוסמכת5.
פותחו שיטות רבות ליצירת עכברים עם גם שימרה גבוה יותר, או לגמרי ES תא נגזר עכברים6,7,8,9,10. בעוד כל אחת ממערכות אלה יש את היתרונות שלה, יש להם גם החסרונות. הדור של tetraploid היו בעת יצירת תאים ES 100% נגזר עכברים, הוא לא יעיל, מוגבל בדרך כלל קווים outbred 5,6. שיטות חדשות של הזרקת morula יכול להניב כימרות אחוז גבוה, מתקרב 100%, אבל בדרך כלל דורשים ציוד נוסף משמעותי (לייזרים או piezos) ואימונים10,11. במעבדות איפה טכניקות אלה שכבר נמצאים במקום, מתודולוגיה חדשה זו ייתכן שלא יהיה צורך.
המטרה של מחקר זה היתה למצוא שיטה המשתמשת טכניקות נפוצות וציוד זמינים כדי להגביר את הקצב של כמירה הדור, ומגדילים את הסיכוי germline שידור של אלל mutant להקים את המושבה העכבר עוקבות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

במאמץ להגדיל את יעילות ביצירת עכברים מהונדסים באמצעות מתודולוגיות ES תא, אנו מציגים עיבוד בפרוטוקול הנוכחי של הזרקת הבלסטוציסט. כאן אנחנו מדווחים כי סיבוב פשוט של העובר, וכן הזרקה דרך טראנס-הפנימית תא בנפח גדול (TICM) גדל אחוז עכברים chimeric מ 31% ל- 50%, עם אין ציוד נוסף או יותר התמחה הדרכה. 26 שונים מוכלאים שיבוטים, שיבוטים הכולל 35 הוזרקו על פני תקופה של 9 חודשים. היה הבדל משמעותי ההריונות או קצב ההחלמה של העוברים בין טכניקות מסורתיות הזרקת TICM. לכן, ללא שינוי כלשהו העיקריים בתהליך הזרקה, מיצוב פשוטה של הבלסטוציסט ואת הזרקת דרך ICM, משחררים את התאים ES לתוך חלל blastocoel יכולים פוטנציאל לשפר את הכמות של ייצור chimeric ובעקבות germline שידור.

מודל לינארי אפקטים מעורבים בטיפול קו תא כאפקט אקראי, שימש כדי לנתח את הנתונים התוכנה (למשל SAS (גרסה 9.2)). כל ניתוח מבוקר על המספר של עוברי העבירה לבין הקו הסלולרי. הניתוח השני מבוקר גם עבור מספר הגורים ששרדו.
במחקר זה, כל שורת ES התאים ולשכפל הו...

Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...