Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
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この研究は、NIH、国立環境衛生研究所の学内研究プログラムによって [一部] 支えられました。統計分析のために Shyamal Peddada 感謝します。私たちはまた彼の継続的なサポートやアドバイスをこの原稿とフランコ DeMayo のレビュー ハンフリー八尾、ゲイリー鳥と結城荒尾を感謝したいと思います。

すべての操作はマウスを NIEHS ノック中核施設の通常の操作の一部として行われました。すべてのマウスが、12:12 で保たれた h: 明暗サイクル NIH 31 と水の食事をしたとアドリブ。動物のケアおよび使用委員会の国立環境衛生研究所に従ってすべての実験を行った。
1. 動物の準備
<ol><li>ドナー マウス、B6 を繁殖 (Cg)-Tyr < c 2 j > B6 に当然のことながら年齢の 8-10 週で/J...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

ICM の妨害につながることを死亡、実際には、現在の胚盤胞マイクロインジェクション プロトコルはまだこの12,13の警告それが長く考えられてしまった。我々 がここで示されているものは、マイクロインジェクション ICM を通して胎児に悪影響はないとキメラの収量を増加させます。
この効果の正確なメカニズムは特定されて?...

約 25 年間、遺伝子ターゲットのマウスの作成は生殖系列キメラを送信の世代のため、胚盤胞 ES 細胞インジェクション段階でしばしばボトルネックによって妨げ、ゆっくりとしたプロセスをされています。CRISPR/Cas91,2 ES 細胞と高スループット ES のターゲットを含む、最近の進歩は携帯サイト制作のような生成コンソーシアム、遺伝子組み換え ES 細胞の生成/可用性を改善しています。ただし、生殖巣キメラの生成は、これらの ES 細胞3,4から遺伝子改変マウスの作成にボトルネック残ります。高スループット ES 細胞世代プロジェクトは、生殖系列キメラの作成に成功のために重大である ES 細胞質の高い変動に悩まされています。さらに、一般利用の ES 細胞株の高い異数性と生殖系列キメラ主務5の困難な生産の知られています。
いずれか高いキメラとマウスを作成するための多くの方法が開発されている、または完全に ES 細胞マウス6,7,8,9,10。これらの各システムは、独自のメリットが、また自分の欠点があります。非効率的、四倍体キメラ、マウス由来 100 %es 細胞の生成間の世代でありザイモグラム行5,6に一般に限られました。桑実胚に注入する新しい方法は、100% に近づいている高パーセントキメラをもたらすが、一般的に重要な追加機器 (レーザーまたは piezos) とトレーニング10,11が必要です。研究所は、これらの技術が既に場所で、この新しい手法が必要場合がかもしれません。
本研究の目的は、後続のマウスのコロニーを確立する突然変異体の対立遺伝子の生殖細胞感染の機会が増え、キメラ世代の率を高めるための一般的な技法と容易に利用可能な機器を使用する方法を見つけることだった。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

ES 細胞の方法論による遺伝子改変マウスの作成の効率を上げるために、現在の胚盤胞の注入のプロトコルへの適応を提案する.単純な回転胚とトランス内部細胞塊 (TICM) を注射が追加の機器の 50% 31% からキメラマウスの割合を増加またはさらに特殊な訓練を行った。26 の異なるクローンを近交系し、9 ヶ月の期間にわたって 35 合計クローンを注入しました。伝統的な注入技術と TICM 間妊娠率や胚の回収率に有意差はありませんでした。したがって、注入プロセスと胚盤胞の単純なポジショニングと ICM を注入することですべての主要な変更、なし胞胚腔腔に ES 細胞を解放可能性があります向上できますキメラの生産、その後量生殖。

ランダム効果として細胞株を扱う、混合効果線形モデルのソフトウェア (例えば SAS (バージョン 9.2)) のデータを分析していました。各解析転送胚とセルの行の数を制御します。生存仔数の制御も 2 番目の分析。
この研究のため各 ES 細胞とクローンは従来の両方が注入されたと TICM テクニック、交互にそれぞれの胚の後 2 ?...

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

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マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

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オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

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Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

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間葉転換を誘導し、上皮の分析

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