Name: trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Bu araştırma [kısmen] Intramural araştırma NIH, Ulusal Enstitüsü Çevre Sağlık Bilimleri Program tarafından desteklenmiştir. İstatistiksel analiz için özel Shyamal Peddada teşekkürler. Biz de Humphrey Yao, Gary kuş ve Yuki Arao incelenmesi bu el yazması ve Franco St onun sürekli destek ve tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm işlemleri fare çekirdek dışarı NIEHS Knock tesisin normal çalışma kapsamında yapıldı. Bütün fareler bir 12:12 tarihinde tutulan s açık: koyu döngüsü ve bir diyet NIH-31 ve su besleme ad libitum. Tüm deneylerin hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü uygun olarak yapıldı.
1. hayvan hazırlık
<ol><li>Doğurmak donör fareler, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, 8-10 hafta-in yaş B6 için doğal olarak (Cg)-Tyr < c...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Uzun ICM herhangi bir rahatsızlık ölüm, aslında, Şu anki blastosist mikroenjeksiyon protokolleri hala bu12,13uyarmak yol açabileceğini zannedildiği. Biz burada göstermiştir ne olduğunu mikroenjeksiyon ICM ile embriyo için zararlı değildir ve chimeras verimini artırır.
Böyle bir sonuç kesin mekanizması tanımlanmamış. Ancak, ICM ve eşlik eden hypoblast, mekanik bozulma ES Hücre entegrasyon mikroenjeksiyon takip y...

Yaklaşık 25 yıl için genetik olarak hedeflenen fareler oluşturulması genellikle bir darboğaz tarafından blastokistlerin ES Hücre mikroenjeksiyon aşamada chimeras verici germline üretimi için engel yavaş bir süreç olmuştur. Son gelişmeler, ES hücre ve yüksek üretilen iş ES hedefleme CRISPR/Cas91,2 de dahil olmak üzere hücre üretimi konsorsiyumlar KOMP gibi genetik olarak değiştirilmiş ES hücre üretimi/durumu düzeldi. Ancak, genetik olarak değiştirilmiş fare bu ES hücreleri3,4den oluştururken bir darboğaz germline chimeras nesil kalır. Yüksek işlem hacmi ES hücre üretimi projeleri germline chimeras başarılı oluşturulması için önemlidir ES Hücre kalitesi yüksek değişkenlik tarafından rahatsız olması. Ayrıca, yaygın olarak kullanılan ES Hücre satırlarından bazıları yüksek anöploidi ve germline yetkili chimeras5zor üretim için bilinir.
Fare ya da daha yüksek bir chimera oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiştir veya tamamen ES Hücre fareler6,7,8,9,10türetilmiş. Bu sistemlerin her biri kendi yararları olsa da, onlar da kendi eksiklikleri var. Verimsiz ve outbred satırları 5,6sınırlı iken % 100 ES Hücre üretme fareler, türetilmiş tetraploid chimeras kuşağıdır. Morula enjekte ederek yeni yöntemleri yüksek oranda chimeras, % 100, yaklaşan verim ama genel olarak önemli ek donanımları (lazerler ya da piezos) ve eğitim10,11gerektirir. Nerede bu teknikler zaten yerde laboratuvarlarda, bu yeni yöntem gerek kalmayabilir.
Bu çalışmanın amacı chimera üretme, sonraki fare koloni kurmak için mutant gen aktarımını germline olasılığını artırma oranı artırmak için ortak teknikleri ve hazır ekipman kullanan bir yöntem bulmak oldu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

Bir çaba ES Hücre metodolojileri ile genetik fareler oluşturulmasında verimliliğini artırmak için biz bir uyum geçerli blastosist enjeksiyon protokolü için mevcut. Burada basit bir rotasyon embriyo ve sızdırma Trans-iç hücre kütlesi (TICM) yoluyla chimeric % %31 50'si, hiçbir ek donanımları ile fareler yüzdesi arttı ya da daha fazla eğitim uzman raporu. 26 farklı klonlar yakın akraba evliliğinden doğan ve 35 toplam klonlar bir 9 ay boyunca enjekte edildi. Geleneksel enjeksiyon teknikleri ve TICM arasında anlamlı bir fark gebelik oranı veya embriyo iyileşme oranı oldu. Bu nedenle, enjeksiyon süreci ve blastosist basit bir konumlandırma ve ICM enjekte herhangi bir önemli değişiklik, ES Hücre blastocoel boşluğa bırakmadan potansiyel chimeric üretim ve sonraki miktar artırabilir germline iletim.

Hücre kültürünü rasgele etkisi olarak tedavi, karışık etkileri Doğrusal model (örneğin SAS (sürüm 9.2)) yazılımında verileri çözümlemek için kullanıldı. Her analiz embriyo transfer ve hücre sayısı için kontrollü. İkinci analiz de hayatta yavru sayısı için kontrol.
Bu çalışma için her ES hücre kültürünü ve klon her ikisi ile geleneksel enjekte ettiler ve TICM teknikleri, her embriyo sonra i...

Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Embriyonik Kök Hücre Tedavi Hindlimb İskemi Türetilmiş Endotel Hücreleri

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...