Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions GM114854 (pour avis) et CA211635 (pour avis), le Arnold et Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator grant (pour avis), le prix DuPont jeune professeur (pour avis), l’American Society for Mass Bourse de recherche de spectrométrie (pour avis) et bourses de la Fondation du Club COSMOS (à R.M.O. et E.P.P.). Les opinions et les conclusions exprimées dans cette publication sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement l’opinion officielle des sources de financement.

Tous les protocoles liés à l’entretien et la manutention de Xenopus laevis ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université George Washington et d’institutionnels animalier (IACUC pas. A311).
1. préparation de l’échantillonnage des Instruments, des médias, des solvants et de plats
<ol>
	<li>Préparer 1 x solution de Steinberg (SS) en dissolvant les sels dans l’eau ultrapure (~18.2 MΩ.cm à 25 ° C) dans l’ordre suivant et aux concentrations in...

Microprobe CE-ESI-MS permet la caractérisation directe des métabolites dans des cellules individuelles en direct, librement des embryons en développement. Au cœur de l’approche sont deux sous-composants techniques, à savoir in situ les Microprélèvement capillaire et haute sensibilité CE-ESI-Mme comparativement à germes entiers dissection, Microprélèvement capillaire a l’avantage d’un fonctionnement rapide (quelques secondes par rapport à 5 min / élément de dissection), compatibilité avec la ...

Une compréhension approfondie du développement embryonnaire nécessite la caractérisation de tous les changements moléculaires qui se déroulent dans chaque cellule de l’organisme en développement. Tandis que Next-Generation Sequencing avec amplification moléculaire permet de mesure profonde des unicellulaires transcriptomes1 en développement systèmes2,3, beaucoup moins on connaît la suite de molécules plus petites produite dans les cellules embryonnaires unique, y compris les protéines et, surtout, de métabolites (masse moléculaire &#60; ~ 1 500 Da). Avec une réponse rapide et dynamique aux événements intrinsèques et extrinsèques, le métabolome est un puissant descripteur d’État moléculaire de la cellule. Le métabolome unicellulaires, soulève donc la possibilité de suivre le développement spatial et temporel de l’hétérogénéité des cellules dans l’embryon précoce et d’identifier de nouvelles molécules pour les études fonctionnelles. Cependant, sans amplification moléculaire disponible pour ces molécules, détection du métabolome exige une sensibilité exceptionnelle à l’aide de la spectrométrie de masse (MS), qui est la technologie de choix pour l’analyse des métabolites.
Unicellulaire MS est une collection de technologies avec une sensibilité suffisante pour mesurer les métabolites dans des cellules individuelles (voir commentaires 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Échantillonnage reproductible des cellules et l’extraction efficace des métabolites sont essentiels à la réussite détection des métabolites dans des cellules individuelles. Dissection de la cellule entière de cellules identifiées d’embryons de Xenopus a permis la caractérisation des petites molécules et de peptides16. Autres approches emploient micropipettes pour échantillonner des cellules vivantes individuelles suivies de détection par ionisation par électrospray (ESI) MS. Par exemple, métabolites ont été mesurés en usine ou des cellules de mammifères par cellule unique vidéo MS17, sonde de pression18, seule sonde19et microscopie force fluidique20, parmi d’autres techniques21, 22,23,24. En outre, l’incorporation de séparation chimique avant d’ionisation dans le flux de travail MS unicellulaires simplifie efficacement le métabolome, atténuant ainsi les interférences potentielles pendant la génération d’ions avant la détection. Ce qui est important, séparation renseigne également composé spécifique afin d’aider à l’identification moléculaire. Électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour détecter des métabolites dans unique disséqués25,26 microsampled27nerveuses, capture de petites molécules différences entre les phénotypes de neurone. Récemment, nous avons adapté CE au tandem ESI MS pour permettre la détection de niveau de trace de centaines de métabolites dans des cellules individuelles qui ont été disséqués de jeunes embryons de Xenopus laevis16,28. Ces études ont révélé des différences métaboliques surprenants entre les cellules à un stade précoce du développement embryonnaires et conduit à la découverte de métabolites avec précédemment inconnue des impacts du développement16.
Ici, nous fournissons un protocole permettant la détection des métabolites dans des cellules individuelles directement dans un embryon de vertébrés vivant à l’aide de la microsonde unicellulaires CE-ESI-MS29,30. L’organisme modèle choisi est la 8 à 32-cellule embryonnaire de X. laevis , bien que l’approche est également applicable aux derniers stades de développement et d’autres types d’organismes modèles. Ce protocole utilise capillaires affûtées multi-axes contrôle traductionnel sous direction par un système d’imagerie à haute résolution d’aspirer une partie de nL ~ 10 de cellules identifiées in situ dans l’embryon en développement morphologiquement complexe. Cette microsonde est évolutif à petites cellules et fonctionne dans les secondes, ce qui est suffisamment rapide pour suivre les lignées cellulaires chez l’embryon. Après extraction de polar ou de petites molécules apolaires, tels que les métabolites et de peptides, de l’échantillon prélevé en environ 4-5 µL de solution d’extraction, un 10 ~ nL de l’extrait obtenu est analysé dans une plate-forme de CE fait sur mesure, couplée à un spectromètre de masse ESI. Construction et l’exploitation de la plate-forme de CE-ESI-MS s’appuie sur les protocoles décrits ailleurs. 31 , 32 l’interface CE-ESI coaxiale est construit comme décrit ailleurs. 31 cette plate-forme est maintenue dans le régime de pulvérisation de cône-jet pour atteindre trace-niveau sensibilité avec une capacité pour la quantification sur une plage de dynamique de journal-ordre de 4-5 (relative28,29,30 ou absolue16). La plateforme de CE-ESI-MS offre 60-amol limite inférieure de détection avec 8 % écart-type relatif (RSD) en analyse quantitative sur une gamme éprouvée de 10 nM à 1 µM pour les petites molécules16, qui suffisent à caractériser les métabolites endogènes dans X. laevis cellules. Microprobed cellules continuent à se diviser au fur et l’embryon par le biais de développement30, permettant une analyse temporellement et spatialement résolue du métabolisme cellulaire. En effet, seule cellule CE-ESI-MS peut être utilisé pour trouver les différences métaboliques entre les cellules qui occupent la dorsale-ventral16,29, animal-végétal16et gauche-droite28 axes du développement ainsi que les cellules qui forment la lignée dorsale vouée de tissu nerveux d’une cellule d’ancêtre commun dans X. laevis30. Outre l’interrogation des différences métaboliques entre différentes cellules embryonnaires à différents stades de développement de l' embryon de X. laevis 30, nous prévoyons que les protocoles décrits ici soient appliquent à un large éventail de biomolécules et microsampled de cellules individuelles des différents stades du développement embryonnaire, mais aussi des autres types de cellules et des organismes modèles. En outre, la microsonde pourrait servir pour Microprélèvement alors qu’une autre plateforme compatible avec minuscules échantillons pourrait être utilisée pour la séparation et/ou la caractérisation des biomolécules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for Embryo Culture Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M 65-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabolite Extraction Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents and Standards for CE-ESI-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>159170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Fabrication Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools (USA) Inc</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Corrosion resitant and autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Sampling Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>Should be vibrationally isolated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-3BZZ</td>
			<td>Stereomicroscope capable of 4.5&#215; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&#8211;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (40 &#181;m/105 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (75 &#181;m/360 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &#181;m ID/OD)</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>21031A</td>
			<td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>Maxis Impact HD</td>
			<td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>ESI-L G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis ver. 4.3 software</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancillary Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10&#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01911005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88300ASP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11475126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

La quantification des petites molécules dans des cellules individuelles déclenche des nouvelles possibilités pour mieux comprendre les processus fondamentaux qui sous-tendent le développement embryonnaire. Pour activer unicellulaires enquêtes directement en embryons vivants, nouvelles approches analytiques sont nécessaires, notamment ceux qui sont sensibles, sélectif, quantitative, robuste et évolutive à la taille des cellules différentes. Nous présentons ici un protocole qui permet l’analyse in situ du métabolisme dans des cellules individuelles à développer librement des embryons de la sud africaine Xenopus laevis (Xenopus laevis), un puissant modèle cellulaire et biologie du développement. Cette approche utilise une microsonde capillaire pour aspirer une partie définie de simples cellules identifiées dans l’embryon, laissant les cellules voisines intactes pour analyse ultérieure. Le contenu de cellules recueillies est analysé par une microéchelle électrophorèse capillaire electrospray ionisation (CE-ESI) interface couplée à un spectromètre de masse à haute résolution en tandem. Cette approche est extensible à différentes tailles de cellule et compatible avec la structure complexe en trois dimensions de l’embryon en développement. Ainsi, nous démontrons que microsonde qu'unicellulaires CE-ESI-MS permet à l’élucidation de l’hétérogénéité métabolique cellulaire qui se déploie comme une cellule progénitrice donne lieu aux descendants au cours du développement de l’embryon. Outre cellulaire et biologie du développement, les protocoles d’analyse unicellulaires décrites ici sont prêtent d’autres tailles de cellules, types de cellules ou des modèles animaux.

Nous avons récemment utilisé microsonde unicellulaires CE-ESI-MS pour caractériser les métabolites dans des cellules individuelles identifiés à développer librement des embryons de Xenopus laevis 29,30. La microsonde permet rapide (~ 5 sec/cellule), in situ l’aspiration d’environ 10 nL d’une cellule individuelle, des aspirations multiples de la même cellule ou plusieurs cellules différentes au sein...

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Les auteurs décrivent les étapes permettant d’échantillonnage rapide in situ d’une petite portion d’une cellule individuelle avec haute précision et une atteinte minimale à l’aide de base capillaire Microprélèvement, pour faciliter la caractérisation chimique d’une capture instantanée de l’activité métabolique dans embryons vivants à l’aide d’une cellule unique sur mesure électrophorèse capillaire et la plate-forme de la spectrométrie de masse.

Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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