Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien GM114854 (, P.N.) und CA211635 (um P.N.), Arnold und Mabel Beckman Stiftung Beckman Young Investigator gewähren (P.N.), die DuPont junge Professor Award (P.N.), der American Society for Mass Massenspektrometrie-Forschungspreis (, P.N.) und COSMOS Club Foundation Fellowships (zur R.M.O. und E.P.P.). Die Meinungen und Schlussfolgerungen in dieser Publikation sind ausschließlich diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen.

Alle Protokolle im Zusammenhang mit der Wartung und Handhabung von Xenopus Laevis wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der George Washington University genehmigt (IACUC keine. A311).
1. Vorbereitung der Probenahme Instrumente, Medien, Lösungsmittel und Gerichte
<ol>
	<li>1 x Steinbergs Lösung (SS) durch Auflösen der folgenden Salze in Reinstwasser (~18.2 MΩ.cm bei 25 ° C) in der folgenden Reihenfolge vorzubereiten und in den angegebenen Konzentratio...

Microprobe CE-ESI-MS ermöglicht die direkte Charakterisierung der Metaboliten in Einzelzellen Leben, frei zu Embryonen entwickeln. Das Herzstück des Konzepts sind zwei technische Unterkomponenten, nämlich in Situ Kapillare Microsampling und hoher Empfindlichkeit CE-ESI-MS. im Vergleich zum gesamten Zelle Dissektion, Kapillare Microsampling hat den Vorteil der schnellen Betrieb (einige Sekunden vs. 5 min / Zelle durch Dissektion), Kompatibilität mit der komplexen dreidimensionalen Morphologie von Embryonen un...

Ein umfassendes Verständnis der embryonalen Entwicklung erfordert Charakterisierung aller molekularen Veränderungen, die in jeder Zelle von den sich entwickelnden Organismus zu entfalten. Während Next-Generation Sequenzierung mit molekulare Verstärkung ermöglicht ist tief Messung von einzelligen Transkriptom1 entwickelnde Systeme2,3, deutlich weniger über die Suite von kleineren Molekülen bekannt. produziert in einzelnen embryonalen Zellen, einschließlich Proteine und insbesondere Metaboliten (molekulare Masse &#60; ~ 1.500 Da). Mit einer schnellen und dynamischen Reaktion auf intrinsische und extrinsische Veranstaltungen dient das Metabolom als eine mächtige Deskriptor der molekularen Zustand einer Zelle. Das einzellige Metabolom wirft daher das Potenzial, die räumliche und zeitliche Entwicklung der Zelle Heterogenität im frühen Embryo zu verfolgen und um neue Moleküle für funktionelle Studien zu identifizieren. Erkennung von das Metabolom verlangt jedoch ohne molekulare Verstärkung für diese Moleküle, außergewöhnlichen Sensibilität mit Massenspektrometrie (MS), die die Technologie der Wahl für Metabolit-Analyse.
Einzellige MS ist eine Sammlung von Technologien mit ausreichender Empfindlichkeit zu Metaboliten in Einzelzellen zu messen (siehe Bewertungen 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reproduzierbare Entnahme von Zellen und effiziente Gewinnung von Metaboliten sind entscheidend für den erfolgreichen Nachweis von Metaboliten in einzelnen Zellen. Ganze Zelle Dissektion der identifizierten Zellen aus Embryonen Xenopus ermöglichte die Charakterisierung von kleinen Molekülen und Peptide16. Andere Ansätze beschäftigen Mikropipetten, gefolgt von Erkennung mit Electrospray Ionisierung (ESI) MS live Einzelzellen zu probieren. Beispielsweise wurden Metaboliten in Anlage oder Säugerzellen durch einzellige video MS17, Druck Sonde18, einzelne Sonde19und fluidische Kraft-Mikroskopie20, unter anderen Techniken21gemessen, 22,23,24. Darüber hinaus vereinfacht die Einbeziehung der chemische Trennung vor der Ionisierung in den einzelligen MS Workflow effizient das Metabolom somit Linderung mögliche Störungen während Ion Generation vor Erkennung. Wichtig ist, informiert Trennung auch substanzspezifischen in molekularen Identifikationen zu unterstützen. Kapillarelektrophorese (CE) wurde zur Metaboliten in einzelnen seziert25,26 oder Microsampled27Neuronen, Erfassung von kleinen Molekül Unterschiede zwischen Neuron Phänotypen erkennen. Wir haben vor kurzem CE an ESI Tandem MS die Ablaufverfolgungsebene Erkennung von Hunderten von Metaboliten in einzelnen Zellen aktivieren, die von den frühen Embryos von Xenopus Laevis16,28seziert wurden angepasst. Diese Studien zeigten sich überraschend metabolische Unterschiede zwischen embryonalen Zellen in einem frühen Stadium der Entwicklung und führte zur Entdeckung von Metaboliten mit bisher unbekannten entwicklungspolitischen Auswirkungen16.
Hier bieten wir eine Protokoll, die den Nachweis von Metaboliten in einzelnen Zellen direkt in einem live vertebrate Embryos mit Mikrosonde einzellige CE-ESI-MS29,30aktiviert. Der Modellorganismus ausgewählt ist die 8-32-Zell laevis Embryo, obwohl der Ansatz auch zu späteren Phasen der Entwicklung und andere Arten von Modellorganismen anwendbar ist. Dieses Protokoll verwendet geschärfte Kapillaren mit mehrachsigen translational Control unter Anleitung von einem hochauflösenden bildgebenden System, ein ~ 10 nL Teil der identifizierten Zellen in Situ die morphologisch Komplex sich entwickelnden Embryos Aspirieren. Diese Mikrosonde ist skalierbar, um kleinere Zellen und betreibt innerhalb von Sekunden, das ist schnell genug, um Zelle Linien im Embryo zu verfolgen. Nach dem Extrahieren von polar oder apolaren kleine Moleküle, wie z. B. Stoffwechselprodukte und Peptide aus der erhobenen Stichprobe in ~ 4-5 µL Extraktionslösung, ~ 10 nL von der daraus resultierenden Extrakt wird in einer speziell angefertigten CE-Plattform mit Bindestrich, ein ESI-Massenspektrometer analysiert. Bau und Betrieb von der CE-ESI-MS-Plattform baut auf Protokolle an anderer Stelle beschrieben. 31 , 32 die co-axial CE-ESI-Schnittstelle ist aufgebaut, wie an anderer Stelle beschrieben. 31 diese Plattform ist in der Kegel-Jet Spritzen Regime Tracelevel Empfindlichkeit mit einer Fähigkeit zur Quantifizierung über einen 4-5 Log-Bestellung Dynamikbereich (relative28,29,30 erreichen gepflegt. oder absolute16). Die CE-ESI-MS-Plattform bietet eine Untergrenze von 60-Amol mit 8 % relative Standardabweichung (RSD) in Quantifizierung über einen geprüften Bereich von 10 nM bis 1 µM für kleine Moleküle16, die ausreichen, um endogene Metaboliten in X zu charakterisieren. Laevis Zellen. Microprobed Zellen weiter teilen im Laufe des Embryo durch Entwicklung30, zulassend zeitlich und räumlich aufgelöste Analyse des zellulären Stoffwechsels. In der Tat können einzellige CE-ESI-MS verwendet werden, um metabolische Unterschiede zwischen den Zellen zu finden, die dorsal-Ventral16,29, Tier-pflanzlichen16, und rechts-links-28 Entwicklungsstörungen Achsen sowie Zellen zu besetzen die Nervengewebe fated dorsale Abstammung von einem gemeinsamen Stammvater Zelle in laevis30bilden. Neben der Abfrage metabolische Unterschiede zwischen einzelnen embryonalen Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien des Embryos laevis 30, wir erwarten, dass die hier beschriebenen Protokolle auf ein breites Spektrum von Biomolekülen anwendbar sind und einzelne Zellen Microsampled von verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung sowie andere Arten von Zellen und Modellorganismen. Darüber hinaus könnte die Mikrosonde für Microsampling verwendet werden, während eine andere Plattform kompatibel mit winzigen Proben für Trennung und/oder Charakterisierung von Biomolekülen verwendet werden könnten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for Embryo Culture Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M 65-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabolite Extraction Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents and Standards for CE-ESI-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>159170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Fabrication Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools (USA) Inc</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Corrosion resitant and autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Sampling Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>Should be vibrationally isolated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-3BZZ</td>
			<td>Stereomicroscope capable of 4.5&#215; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&#8211;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (40 &#181;m/105 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (75 &#181;m/360 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &#181;m ID/OD)</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>21031A</td>
			<td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>Maxis Impact HD</td>
			<td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>ESI-L G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis ver. 4.3 software</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancillary Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10&#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01911005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88300ASP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11475126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

Die Quantifizierung von kleinen Molekülen in Einzelzellen wirft neue Potenziale für ein besseres Verständnis der grundlegenden Prozesse, die Embryonalentwicklung zugrunde liegen. Aktivieren einzellige Untersuchungen direkt in live Embryonen, neue analytische Ansätze erforderlich sind, insbesondere die sensiblen, selektive quantitative, robust und skalierbar zu verschiedenen Zellgrößen. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die in Situ -Analyse des Stoffwechsels in einzelnen Zellen bei der Entwicklung von Embryonen von der südafrikanischen krallenbewehrten Frosch (Xenopus Laevis), ein leistungsfähiges Modell in Zell- und Entwicklungsbiologie frei ermöglicht. Dieser Ansatz nutzt eine Kapillare Mikrosonde um einen definierten Teil aus einzelnen identifizierten Zellen des Embryos, die benachbarte Zellen intakt für die spätere Analyse Aspirieren. Die gesammelten Zellinhalt wird durch eine Microscale Kapillarelektrophorese Electrospray Ionisierung (CE-ESI) Schnittstelle gekoppelt mit einem hochauflösenden Tandem-Massenspektrometer analysiert. Dieser Ansatz ist skalierbar, um verschiedenen Zellgrößen und kompatibel mit den komplexen dreidimensionalen Struktur des sich entwickelnden Embryos. Als Beispiel zeigen wir, dass Mikrosonde einzellige CE-ESI-MS die Aufklärung der metabolischen Zelle Heterogenität, die entfaltet sich ermöglicht wie eine Vorfahr Zelle Nachkommen während der Entwicklung des Embryos entstehen. Neben Zell- und Entwicklungsbiologie sind einzellige Analyseprotokolle hier beschriebenen anderen Zellengrößen, Zelltypen oder Tiermodellen zugänglich.

Wir Beschäftigten vor kurzem Mikrosonde einzellige CE-ESI-MS Metaboliten in einzelnen identifizierten Zellen bei der Entwicklung von Xenopus Laevis Embryonen29,30frei zu charakterisieren. Die Mikrosonde ermöglicht die schnelle (~ 5 sec/Zelle), in Situ Aspiration von ~ 10 nL aus einer einzelnen Zelle, mehrere Bestrebungen der gleichen Zelle oder mehrere verschiedene Zellen in den gleichen oder späteren Stadien ...

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Wir beschreiben Schritte, mit denen schnell in Situ Probenahme von einen kleinen Teil einer einzelnen Zelle mit hoher Präzision und minimalen Invasion mit Kapillar-basierten Mikro-Probenahme, chemische Charakterisierung einer Momentaufnahme der metabolischen Aktivität in zu erleichtern Embryonen mit einer speziell angefertigten Einzelzelle Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie-Plattform zu leben.

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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