Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute sovvenzioni GM114854 (a P.N.) e CA211635 (a P.N.), Arnold e Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator concedere (a P.N.), il premio DuPont giovane professore (a P.N.), la società americana per la massa Premio ricerca spettrometria (a P.N.) e COSMOS Club Fondazione borse di studio (per R.M.O. ed E.P.P). Le opinioni e conclusioni espresse in questa pubblicazione sono unicamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale delle fonti di finanziamento.

Tutti i protocolli relativi alla manutenzione e gestione di Xenopus laevis sono stati approvati dal comitato di uso alla George Washington University e istituzionali Animal Care (IACUC no. A311).
1. preparazione del campionamento strumenti, Media, solventi e degustazione di piatti
<ol>
	<li>Preparare la soluzione di Steinberg (SS) 1x sciogliendo i seguenti sali in acqua ultrapura (~18.2 MΩ.cm a 25 ° C) nel seguente ordine e alle concentrazioni indicate seguendo uno standard di pro...

MicroProbe CE-ESI-MS consente la caratterizzazione diretta dei metaboliti in singole cellule in vivo, liberamente lo sviluppo di embrioni. Nel cuore dell'approccio sono due tecniche sottocomponenti, vale a dire in situ capillare microcampionamento e ad alta sensibilità CE-ESI-MS. rispetto alla dissezione di cellule intere, Microcampionamento capillare ha il vantaggio di funzionamento veloce (pochi secondi vs 5 min / cella di dissezione), compatibilità con la complessa morfologia tridimensionale di embrioni e s...

Una comprensione globale dello sviluppo embrionale richiede la caratterizzazione di tutti i cambiamenti molecolari che si dipanano in ogni cellula dell'organismo in via di sviluppo. Mentre la Next-Generation Sequencing con amplificazione molecolare permette profonda misura di singola cellula trascrittomi1 in sviluppo sistemi2,3, considerevolmente di meno è conosciuto circa la suite di molecole più piccole prodotta in singole cellule embrionali, tra cui proteine e, soprattutto, metaboliti (massa molecolare &#60; Da ~ 1.500). Con una risposta veloce e dinamica agli eventi intrinseci ed estrinseci, il metaboloma serve come un potente descrittore dello stato molecolare di una cella. Il metaboloma unicellulare, pertanto, aumenta il potenziale di seguire l'evoluzione spaziale e temporale delle eterogeneità cellulare nell'embrione precoce e di identificare nuove molecole per studi funzionali. Tuttavia, senza amplificazione molecolare disponibile per queste molecole, rilevamento del metaboloma esige sensibilità eccezionale utilizzando la spettrometria di massa (MS), che è la tecnologia scelta per analisi del metabolita.
Cella singola MS è un insieme di tecnologie con sufficiente sensibilità per misurare i metaboliti in singole cellule (Vedi recensioni 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Riproducibile campionamento delle cellule ed efficiente estrazione di metaboliti sono essenziali per l'individuazione dei metaboliti in singole cellule. La dissezione della intero-cellula delle cellule identificate da embrioni di Xenopus ha permesso la caratterizzazione di piccole molecole e peptidi16. Altri approcci utilizzano micropipette a campione singole celle dal vivo seguite da rilevamento tramite ionizzazione electrospray (ESI) MS. Ad esempio, i metaboliti sono stati misurati in pianta o cellule di mammifero di cella singola video MS17, pressione sonda18, singola sonda19e microscopia forza fluidico20, fra le altre tecniche21, 22,23,24. Inoltre, incorporazione di separazione chimica prima ionizzazione nel flusso di lavoro MS unicellulare semplifica in modo efficiente il metaboloma, attenuando le potenziali interferenze durante la generazione di ioni prima del rilevamento. D'importanza, separazione fornisce anche informazioni specifiche del composto per assistere in identificazioni molecolari. Elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per rilevare metaboliti nei neuroni2726 o microsampled singoli dissecata25,, acquisizione della piccolo-molecola differenze tra fenotipi del neurone. Abbiamo recentemente adattato CE a tandem ESI MS per abilitare il rilevamento del livello di traccia di centinaia di metaboliti in singole celle che sono stati sezionati da primi embrioni di Xenopus laevis16,28. Questi studi hanno rivelato sorprendenti differenze metaboliche tra cellule embrionali in una fase iniziale di sviluppo e ha portato alla scoperta di metaboliti con precedentemente sconosciuto inerente allo sviluppo impatti16.
Qui forniamo un protocollo che abilitato il rilevamento dei metaboliti in singole cellule direttamente in un embrione di vertebrati dal vivo usando della microsonda unicellulare CE-ESI-MS29,30. L'organismo di modello scelto è la 8-32-cellula dell'embrione X. laevis , anche se l'approccio è applicabile anche alle successive fasi di sviluppo e altri tipi di organismi modello. Questo protocollo utilizza capillari affilati con il controllo traduzionale multiasse sotto la Guida di un sistema di imaging ad alta risoluzione per aspirare un ~ 10 nL parte delle cellule identificate in situ nell'embrione di sviluppo morfologicamente complessa. Questa microsonda è scalabile a celle più piccole e opera in pochi secondi, che è sufficientemente veloce per tenere traccia di stirpi delle cellule nell'embrione. Dopo l'estrazione polare o piccole molecole apolari, quali metaboliti e peptidi, dal campione prelevato in ~ 4-5 µ l di soluzione estrazione, un ~ 10 nL dell'estratto risultante viene analizzata in una piattaforma CE fuoriserie sillabata ad uno spettrometro di massa ESI. Costruzione e funzionamento della piattaforma CE-ESI-MS sfrutta i protocolli descritti altrove. 31 , 32 l'interfaccia CE-ESI co-axial è costruito come descritto altrove. 31 questa piattaforma è mantenuta in regime di spruzzatura getto a cono per raggiungere livello di traccia sensibilità con una capacità per quantificazione sopra una gamma dinamica (relativo28,29,30 Registro-ordine di 4-5 o assoluto16). La piattaforma di CE-ESI-MS offre un limite inferiore di 60-amol di rilevamento con 8% deviazione standard relativa (RSD) nella quantificazione sopra una gamma testata di 10 nM a 1 µM per piccole molecole16, che sono sufficienti per caratterizzare metaboliti endogeni in X. laevis cellule. Microprobed cellule continuano a dividersi il progredire dell'embrione attraverso sviluppo30, consentendo analisi temporalmente e spazialmente risolto del metabolismo cellulare. Infatti, la cella singola CE-ESI-MS può essere utilizzato per trovare differenze metaboliche tra cellule che occupano il dorso-ventrale16,29, animale-vegetale16e sinistra-destra28 assi dello sviluppo così come le cellule che formano il tessuto neurale fated lignaggio dorsale da una cellula progenitrice comune in X. laevis30. Oltre a una query su differenze metaboliche tra le singole celle embrionali nelle diverse fasi dello sviluppo dell' embrione X. laevis 30, prevediamo che i protocolli descritti qui sono applicabili a una vasta gamma di biomolecole e microsampled di cellule singole da diversi stadi di sviluppo embrionale, così come altri tipi di cellule e organismi modello. Inoltre, la microsonda potrebbe essere utilizzata per Microcampionamento, mentre un'altra piattaforma compatibile con minuscoli campioni potrebbe essere usata per separazione e/o caratterizzazione di biomolecole.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for Embryo Culture Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M 65-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabolite Extraction Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents and Standards for CE-ESI-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>159170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Fabrication Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools (USA) Inc</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Corrosion resitant and autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Sampling Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>Should be vibrationally isolated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-3BZZ</td>
			<td>Stereomicroscope capable of 4.5&#215; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&#8211;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (40 &#181;m/105 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (75 &#181;m/360 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &#181;m ID/OD)</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>21031A</td>
			<td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>Maxis Impact HD</td>
			<td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>ESI-L G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis ver. 4.3 software</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancillary Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10&#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01911005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88300ASP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11475126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

La quantificazione di piccole molecole in singole cellule genera nuove potenzialità per comprendere meglio i processi di base che sottendono lo sviluppo embrionale. Per abilitare unicellulare indagini direttamente in embrioni dal vivo, nuovi approcci analitici sono necessari, specialmente quelli che sono sensibile, selettiva, quantitativa, robusta e scalabile per celle di diverse dimensioni. Qui, presentiamo un protocollo che consente l'analisi in situ di metabolismo in singole cellule liberamente lo sviluppo di embrioni di Rana artigliata dell'africano del Sud (Xenopus laevis), un potente modello in biologia cellulare e dello sviluppo. Questo approccio utilizza una microsonda capillare per aspirare una porzione definita da singole cellule identificate nell'embrione, lasciando le cellule vicine intatto per la successiva analisi. Il contenuto della cella raccolti è analizzato da un interfaccia su microscala elettroforesi capillare electrospray ionizzazione (CE-ESI) accoppiato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione tandem. Questo approccio è scalabile a vari formati di cella e compatibile con la struttura tridimensionale complessa dell'embrione in via di sviluppo. Ad esempio, dimostriamo che microsonda che unicellulare CE-ESI-MS consente la delucidazione di eterogeneità metabolica delle cellule che si dispiega come una cellula del progenitor dà luogo a discendenti durante lo sviluppo dell'embrione. Oltre a cellulare e biologia dello sviluppo, i protocolli di analisi unicellulare descritti qui sono suscettibili di altre celle di dimensioni, tipi cellulari o modelli animali.

Abbiamo recentemente impiegato della microsonda unicellulare CE-ESI-MS per la caratterizzazione di metaboliti in singole cellule identificate nello sviluppo liberamente di Xenopus laevis embrioni29,30. La microsonda consente il veloce (~ 5 sec/cell), in situ aspirazione di ~ 10 nL da una singola cella, le aspirazioni multiple della stessa cella o più celle diverse entro la stesse o versioni successive fasi dello...

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l'invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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