Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

이 작품은 국립 연구소의 건강 보조금 GM114854 (P.N.)에 의해 지원 되었다 및 (P.N.)에 CA211635, 아놀드와 벨 베크만 재단 베크만 영 탐정 부여 (P.N.)는 듀 폰 영 교수 수상 (P.N.), 질량에 대 한 미국 사회 분석 연구 수상 (P.N.), 그리고 (R.M.O. E.P.P.)를 우주 클럽 재단 장학. 의견 및이 책에서 표현 하는 결론은 전적으로 그 저자 고 반드시 자금 출처의 공식 의견을 대표 하지는 않습니다.

유지 보수에 관련 된 모든 프로토콜 및 Xenopus laevis 의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회 조지 워싱턴 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC 없습니다. A311)입니다.
1. 악기, 미디어, 용 매, 샘플링 하 고 샘플링 요리 준비
<ol>
	<li>다음 순서로 초순 (25 ° C에서 ~18.2 MΩ.cm)에 다음과 같은 염을 용 해 하 여 스타의 솔루션 (SS) x 1을 준비 하 고 표준에 따라 지정 된 농도에서<sup class="x...

현미경 CE-ESI-MS 라이브, 자유롭게 개발 배아에 단일 세포에서 대사 산물의 직접 특성을 수 있습니다. 접근 방법의 핵심은 두 가지 기술 하위 구성 요소, 즉 제자리에서 모 세관 microsampling 및 높은 감도 CE-ESI-양 전체 셀 절 개에 비해, 모 세관 microsampling는 빠른 작업 (몇 초 5 분 대의 이점이 있다 / 해 부에 의해 셀), 배아, 그리고 개발의 나중 단계에서 형성 하는 작은 세포를 확장성의 복잡 한 3 ?...

배아 발달에 대 한 포괄적인 이해 특성화를 발전 유 기체의 모든 세포에 전개 된 모든 분자 변경 필요 합니다. 수 분자 확대와 차세대 시퀀싱 하는 동안 깊은 측정 개발 시스템2,3, 상당히 적은 단일 셀 transcriptomes1 의 작은 분자의 집합에 대 한 알려져 있다 단백질 및, 특히, 대사 산물을 포함 하 여 단일 배아 세포에서 생산 (분자 질량 &#60; ~ 1500 다). 내부 및 외부 이벤트에 신속 하 고 동적 응답,는 대사체 셀의 분자 상태의 강력한 설명자 역할을 합니다. 단일 셀 대사체 따라서 셀이 초기 배아에서의 공간 및 시간 개발을 추적 하 고 기능 연구에 대 한 새로운 분자 식별 가능성이 발생 합니다. 그러나,이 분자에 사용할 수 있는 분자 증폭, 없이 대사체의 뛰어난 감도 사용 하 여 질량 분석 (MS), 대사 산물 분석에 대 한 선택의 기술 요구.
단일 셀 MS (참조 리뷰 4,,56,7,8,9 단 세포 대사 산물을 측정 하기 위해 충분 한 감도와 기술의 모음입니다. ,10,11,12,13,,1415). 셀의 재현 샘플링 및 대사 산물의 효율적 추출 단일 세포에서 대사 산물의 성공적인 탐지에 필수적입니다. Xenopus 배아에서 식별 된 셀의 전체 셀 해 부는 작은 분자의 펩 티 드16특성을 활성화 하 고 있다. 다른 접근 탐지 분무 이온화 (ESI) MS 사용 하 여 다음 개별 라이브 셀 샘플을 micropipettes를 사용 합니다. 예를 들어 대사 산물 단일 셀 비디오 MS17, 압력 프로브18, 단일 프로브19, 및 유체 힘 현미경20, 다른 기술21, 중 식물이 나 포유류 세포에서 측정 했다 22,,2324. 또한, 단일 셀 MS 워크플로에 이온화 전에 화학 분리의 효율적으로 대사체, 따라서 검색 하기 전에 이온 생성 하는 동안 잠재적인 간섭 경감을 단순화 합니다. 중요 한 것은, 분리는 또한 분자 식별을 지원 하기 위해 화합물 관련 정보를 제공 합니다. 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 단일 해 부25,26 또는 microsampled27뉴런, 신경 고기 작은 분자 차이 캡처 metabolites를 감지에 사용 되었습니다. 우리는 최근 ESI 탠덤 Xenopus laevis16,28의 초기 배아에서 해 부 했다 개별 셀에 대사 산물의 수백의 추적 수준 검색 사용 하려면 MS에 CE를 적응. 이러한 연구 개발의 초기 단계에서 배아 세포 간의 놀라운 변화 차이 공개 하 고 알 수 없는 발달에 미치는 영향16와 대사 산물의 발견에 지도 했다.
여기 우리는 살아있는 척추 동물 배아 있지만 단일 셀 CE-ESI-MS29,30을 사용 하 여 직접 단일 셀에 대사 산물의 탐지를 사용 하는 프로토콜을 제공 합니다. 선택한 모델 유기 체는 8-하-32-셀 X. laevis 배아 접근 개발 및 모델 생물의 다른 종류의 나중의 단계에 적용 됩니다. 이 프로토콜 ~ 10 nL 부분 확인 된 셀에 제자리에 형태학 상으로 복잡 한 발전 태아에서의 발음을 고해상도 이미징 시스템으로 지도 다축 변환 제어 날카롭게 모세를 사용 합니다. 이 있지만 작은 셀에 확장 하 고는 태아에서 세포 계보를 추적 하기 위해 충분히 빨리 초 이내에, 작동 한다. 극 지 추출 또는 apolar 작은 분자 대사 산물 등 4 ~ 5에서 수집 된 샘플에서 펩 티 드 후 µ L 추출 솔루션, ~ 10 결과 추출의 nL ESI 질량 분석기에 하이픈이 맞춤식 CE 플랫폼에서 분석 된다. 건설 및 CE-ESI-MS 플랫폼의 다른 곳에서 설명 하는 프로토콜에 작성 합니다. 31 , 32 동축 CE ESI 인터페이스 설명 되어 있는 대로 구성 되어 있습니다. 31 이 플랫폼은 4-5 로그 순서 동적 범위 (상대28,29,30 추적 수준 감도 정량화에 대 한 기능을 달성 하기 위해 콘 제트 분사 정권 유지 또는 절대16). CE-ESI-MS 플랫폼 정량에 10의 테스트 범위는 60-박 한 8% 상대 표준 편차 (RSD)와 탐지의 제공 nM 1 µ m 작은 분자16, X에에서 내 인 성 대사 산물의 특성을 충분 한입니다. laevis 셀. Microprobed 셀 분할 개발30, 세포질 물질 대사의 해결된 일시적으로 그리고 공간 분석에 대 한 허용을 통해 배아 진행으로 계속. 실제로, 단일 셀 CE-ESI-MS 대사 차이 복 부 등16,29, 동물 식물16, 그리고 왼쪽 오른쪽28 개발 축으로 셀을 차지 하는 셀을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 그 X. laevis30에서 일반적인 조상 세포에서 신경 조직 운명 등 계보를 형성 한다. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 생체의 광범위 한 배열에 적용 되는 예상 쿼리 X. laevis 배아30의 다른 발달 단계에서 개별 배아 세포의 대사 차이, 외 고 단일 셀 셀 및 모델 생물의 배아 발달의 다른 단계에서 microsampled. 또한, 다른 플랫폼 호환-조금만 샘플 분리 및 생체의 특성에 사용할 수 있습니다.는 있지만 microsampling에 사용 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for Embryo Culture Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M 65-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabolite Extraction Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents and Standards for CE-ESI-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>159170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Fabrication Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools (USA) Inc</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Corrosion resitant and autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Sampling Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>Should be vibrationally isolated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-3BZZ</td>
			<td>Stereomicroscope capable of 4.5&#215; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&#8211;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (40 &#181;m/105 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (75 &#181;m/360 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &#181;m ID/OD)</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>21031A</td>
			<td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>Maxis Impact HD</td>
			<td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>ESI-L G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis ver. 4.3 software</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancillary Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10&#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01911005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88300ASP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11475126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

단일 셀에 작은 분자의 정량화 더 나은 이해 배아 개발의 기반이 되는 기본 프로세스에 대 한 새로운 전위를 발생 시킵니다. 사용 단일 셀 조사에 직접 라이브 배아, 새로운 분석 접근 필요, 특히 그 민감한, 선택적, 양적, 강력 하며 확장 가능한 다른 셀 크기를. 여기, 선물이 자유롭게 개발 남쪽 아프리카 발톱된 개구리 (Xenopus laevis), 세포 및 개발 생물학에서 강력한 모델의 배아에 단일 셀에 대사의 분석 제자리에 있도록 하는 프로토콜. 이 방법은 모 세관 현미경을 사용 하 여 후속 분석을 위해 인접 셀 그대로 태아에 단일 식별 된 셀에서 정의 된 부분을 발음. 수집 된 셀 내용은 고해상도 탠덤 질량 분석기를 결합 하는 미 모 세관 전기 이동 법 분무 이온화 (CE-ESI) 인터페이스에 의해 분석 된다. 이 방식은 다양 한 셀 크기를 확장 하 고 발전 태아의 복잡 한 3 차원 구조와 호환 합니다. 예를 들어, 단일 셀 CE-ESI-MS 조상 세포 생겨나게 자손에 게 태아의 개발로 펼쳐져 대사 셀이 해명 수는 있지만을 설명 합니다. 세포 및 발생 생물학, 게다가 여기에 설명 된 단일 세포 분석 프로토콜은 의무가 다른 세포 크기, 세포 유형, 또는 동물 모델입니다.

우리는 최근 있지만 단일 셀 고용 CE-ESI-MS 자유롭게 Xenopus laevis 배아29,30개발에 개별 확인 된 셀에 대사 산물의 특성. 있지만 빨리 가능 (~ 5 초/셀), 제자리에 ~ 10의 포부 nL 개별 셀, 같은 셀의 여러 포부 또는 라이브 배아 (그림 1b)의 개발의 동일한 이상 단계 내의 여러 다른 셀에서. Aspirated 셀룰?...

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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