Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios GM114854 (de Parque Nacional) e CA211635 (de Parque Nacional), o Arnold e Mabel Beckman Fundação Beckman Young Investigator concedem (Parque Nacional), o prêmio DuPont jovem Professor (de Parque Nacional), a sociedade americana para a missa Prêmio de pesquisa espectrometria (de Parque Nacional) e bolsas COSMOS Club Foundation (para R.M.O e E.P.P.). As opiniões e conclusões expressadas nesta publicação são exclusivamente dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial das fontes de financiamento.

Todos os protocolos relacionados à manutenção e manipulação de Xenopus laevis foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade George Washington e institucional Cuidado Animal (IACUC nenhum. A311).
1. preparação dos instrumentos, meios de comunicação, solventes de amostragem e pratos de amostragem
<ol>
	<li>Preparar 1 x solução de Steinberg (SS), dissolvendo os seguintes sais em água ultrapura (~18.2 MΩ.cm a 25 ° C), na seguinte ordem e nas concentrações indicadas...

Microprobe CE-ESI-MS permite a caracterização directa dos metabolitos em células únicas em viver, livremente desenvolver embriões. O cerne da abordagem são dois subcomponentes técnicas, nomeadamente em situ microsampling capilar e alta sensibilidade CE-ESI-MS. em comparação à dissecação de células inteiras, microsampling capilar tem a vantagem de operação rápida (alguns segundos vs 5 min pilha / por dissecação), compatibilidade com a morfologia tridimensional complexa de embriões e escalabilid...

Uma compreensão abrangente do desenvolvimento embrionário exige caracterização de todas as alterações moleculares que se desenrolam em cada célula do organismo em desenvolvimento. Enquanto a próxima geração de sequenciamento com amplificação molecular permite medição profunda de célula única transcriptomes1 em desenvolvimento sistemas2,3, consideravelmente menos é conhecida sobre o conjunto de moléculas menores produzido em células embrionárias única, incluindo proteínas e, especialmente, metabólitos (massa molecular &#60; Da ~ 1.500). Com uma resposta rápida e dinâmica de eventos intrínsecos e extrínsecos, o metabolome serve como um poderoso descritor de estado molecular da célula. O metabolome de célula única, portanto, aumenta o potencial para acompanhar o desenvolvimento espacial e temporal da heterogeneidade celular no embrião precoce e identificar novas moléculas para estudos funcionais. No entanto, sem amplificação molecular disponível para estas moléculas, deteção da metabolome exige sensibilidade excepcional utilizando espectrometria de massa (MS), que é a tecnologia de escolha para a análise do metabólito.
MS de célula única é uma coleção de tecnologias com sensibilidade suficiente para medir metabólitos em células individuais (ver comentários 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reprodutível amostragem de células e extração eficiente de metabólitos são essenciais para a detecção bem sucedida de metabólitos em células únicas. Dissecação de células inteiras de identificadas células de embriões de Xenopus permitiu a caracterização de moléculas pequenas e peptídeos16. Outras abordagens empregam micropipetas para células individuais ao vivo, seguidas de deteção usando ionização electrospray (ESI) MS da amostra. Por exemplo, metabólitos foram medidos na planta ou células de mamíferos por célula única vídeo MS17, sonda de pressão18, única sonda19e microscopia fluídico força20, entre outras técnicas21, 22,23,24. Além disso, a incorporação de separação química antes de ionização para o fluxo de trabalho MS monocelulares eficientemente simplifica a metabolome, aliviando assim, a potenciais interferências durante a geração de íon antes da detecção. Importante, a separação também fornece informações específicas do composto para auxiliar na identificação molecular. Eletroforese capilar (CE) tem sido usado para detectar metabolitos nos neurônios de2726 ou microsampled único dissecado25,, capturando pequeno-molécula diferenças entre fenótipos de neurônio. Nós recentemente adaptado CE para ESI em tandem MS para habilitar a detecção de nível de rastreamento de centenas de metabólitos em células individuais que foram dissecados de embriões adiantados do Xenopus laevis16,28. Estes estudos revelaram diferenças metabólicas surpreendentes entre células embrionárias na fase inicial de desenvolvimento e levaram à descoberta de metabólitos com anteriormente desconhecidos impactos no desenvolvimento16.
Aqui nós fornecemos um protocolo que permitiu a detecção de metabólitos em únicas pilhas diretamente em um embrião de vertebrados ao vivo usando microsonda monocelulares CE-ESI-MS29,30. O organismo modelo escolhido é a 8-a-32-célula X. laevis embrião, embora a abordagem também é aplicável aos últimos estágios de desenvolvimento e outros tipos de organismos modelo. Este protocolo usa capilares afiados com multi-eixo controle translacional sob orientação por um sistema de imagens de alta resolução para aspirar uma porção de nL ~ 10 de células identificadas em situ no desenvolvimento do embrião morfologicamente complexo. Este microsonda é escalável para células menores e opera dentro de segundos, que é suficientemente rápido para acompanhar as linhagens de células no embrião. Depois de extrair polar ou apolar pequenas moléculas, tais como metabólitos e peptides, da amostra coletada em ~ 4-5 solução de extração µ l, uma ~ 10 nL do extrato resultante é analisada em uma plataforma de CE Custom-Built hifenizada de um espectrômetro de massa ESI. Construção e operação da plataforma CE-ESI-MS baseia-se em protocolos descritos em outro lugar. 31 , 32 a interface CE-ESI co-axial é construída conforme descrito em outro lugar. 31 esta plataforma é mantida no regime de pulverização de cone-jato para atingir o nível de rastreamento sensibilidade, com uma capacidade para quantificação sobre uma gama dinâmica de log-ordem de 4-5 (relativo28,29,30 ou absoluto16). A plataforma de CE-ESI-MS oferece um limite de detecção com 8% desvio-padrão relativo (RSD) 60-amol na quantificação sobre um intervalo testado de 10 nM a 1 µM para pequenas moléculas,16, que são suficientes para caracterizar metabólitos endógenos, em X. laevis células. Microprobed células continuam a dividir-se no decorrer do embrião, através de desenvolvimento30, permitindo a análise temporal e espacialmente resolvido de metabolismo celular. De facto, única célula CE-ESI-MS pode ser usado para encontrar diferenças metabólicas entre as células que ocupam o dorso-ventral16,29, animal-vegetal,16e esquerda-direita28 eixos do desenvolvimento bem como células que formam a tecido neural predestinada linhagem dorsal de uma célula progenitora comum em X. laevis30. Além de consultar as diferenças metabólicas entre células embrionárias individuais em diferentes fases do desenvolvimento do embrião X. laevis 30, prevemos que os protocolos aqui descritos são aplicáveis a uma ampla gama de biomoléculas e microsampled de células individuais de diferentes fases do desenvolvimento embrionário, bem como outros tipos de células e organismos-modelo. Além disso, a microsonda poderia ser usada para microsampling enquanto uma plataforma diferente compatível com amostras minúsculas pode ser usada para a separação e/ou caracterização de biomoléculas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents for Embryo Culture Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M 65-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metabolite Extraction Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents and Standards for CE-ESI-MS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11710X1-AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (LC-MS-grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5641-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>159170050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Fabrication Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropippette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools (USA) Inc</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Corrosion resitant and autoclavable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobe Sampling Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>TransferMan 4r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>Should be vibrationally isolated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator e.g. Goosenecks</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-FLED2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Warner Instrument, Handem, CT</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S08184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CE-ESI-MS Setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE1000R</td>
			<td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pumps (2)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-3BZZ</td>
			<td>Stereomicroscope capable of 4.5&#215; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ translation stage</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&#8211;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel sample vials</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel BGE vial</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (40 &#181;m/105 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP040105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (75 &#181;m/360 &#181;m ID/OD; 100 cm)</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &#181;m ID/OD)</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>21031A</td>
			<td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &#181;L</td>
			<td>Hamilton Co.</td>
			<td>1750TTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>Maxis Impact HD</td>
			<td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>ESI-L G1969-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis ver. 4.3 software</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancillary Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&#8211;10&#176;C</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7310022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01911005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>97-926-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88300ASP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11475126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-mixer</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BS-VM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

A quantificação de pequenas moléculas em células únicas gera novos potenciais para melhor compreender os processos básicos que fundamentam o desenvolvimento embrionário. Para habilitar monocelulares investigações diretamente em embriões vivos, novas abordagens analíticas são necessários, especialmente aqueles que são sensíveis, seletiva, quantitativos, robusta e escalável para tamanhos diferentes da célula. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a análise em situ do metabolismo nas células únicas no livremente desenvolvimento de embriões do Sul Africana Xenopus (Xenopus laevis), um poderoso modelo em biologia celular e do desenvolvimento. Esta abordagem usa uma microsonda capilar para aspirar uma porção definida de simples células identificadas no embrião, deixando as células vizinhas intactas para análise posterior. O conteúdo da célula coletado é analisado por uma interface de microescala eletroforese capilar electrospray ionização (CE-ESI) acoplada a um espectrômetro de massa em tandem de alta resolução. Esta abordagem é escalável para vários tamanhos de célula e compatível com a complexa estrutura tridimensional do embrião em desenvolvimento. Como exemplo, demonstramos que microsonda que monocelulares CE-ESI-MS permite a elucidação de heterogeneidade celular metabólica que se desdobra como uma célula progenitora dá origem a descendentes durante o desenvolvimento do embrião. Além de célula e biologia do desenvolvimento, os protocolos de célula única análise descritos aqui são aptos para outros tamanhos de células, tipos de células ou modelos animais.

Nós recentemente empregados microsonda monocelulares CE-ESI-MS para caracterizar metabólitos em células individuais identificados livremente desenvolver embriões de Xenopus laevis 29,30. A microsonda permite rápido (~ 5 seg/cell), em situ aspiração de ~ 10 nL de uma célula individual, múltiplas aspirações da mesma célula, ou várias células diferentes dentro da mesmas ou posteriores estágios de dese...

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Descrevemos as etapas que permitem rápida situ em amostragem de uma pequena porção de uma célula individual com alta precisão e mínima invasão usando microamostragem baseada em capilar, para facilitar a caracterização química de um instantâneo da atividade metabólica em viver de embriões utilizando uma plataforma de espectrometria de massa e eletroforese capilar Custom-Built única célula.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

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Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...