Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Anthony Bowen hvis dias blev brugt som en anden menneskelig side-by-side sammenligning samt Sabrina Nolan hvis dias blev brugt som en tredje menneskelige side-by-side og anden mikroskop sammenligning.

1. forberedelse af tusch dias
<ol><li>Tilsæt 10 µL af cryptococcal prøve på et dias. Enhver cirkulære gærstamme vil arbejde men for dette eksperiment H99 var de eneste stamme anvendes. Bemærk: Hvis prøven er direkte fra dyrkningsmedier, fortynding 1:2 med PBS eller vand kan hjælpe med at forhindre tusch fra sammenklumpning.</li>
	<li>Der afpipetteres 2 µL af tusch plet på prøven og bland ved fysisk at skubbe pipette tip til prøven og bevæger sig i en cirkulær bevægelse, indtil tusch vises jævnt ford...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

De kritiske trin af denne teknik forbereder tusch dias og erhverve mikroskop billeder. Mens algoritmen, der er testet med succes med en række dias og billede teknikker er anbefalede protokollen beskrevet i dette håndskrift. Polysaccharid kapsel er opdaget, baseret på udelukkelse af tusch partikler fra domænet af kapslen, da disse partikler er for store til at trænge polysaccharid fibril netværk. Tusch udstødelse resulterer i en lys cirkel på toppen af en mørk baggrund. Algoritmen registrerer cirkler baseret på ...

Cryptococcus neoformans er en patogene gær fundet allestedsnærværende rundt om i verden, der er forbundet med human sygdom primært i immunosuppressed populationer. C. neoformans især tegner sig for en væsentlig årsag til samlede årlige dødsfald i Sub-Sahara Afrika på grund af smitsom sygdom1. Den store kliniske manifestation af cryptococcal infektion er meningoencephalitis, som følger invasion af centralnervesystemet ved transport i inficerede makrofager (trojansk hest måde) eller direkte passage af blod - hjerne barrieren. C. neoformans udtrykker flere virulens faktorer herunder evnen til at replikere på menneskets kropstemperatur, urease aktivitet, melanization og dannelsen af et polysaccharid kapsel2. Polysaccharid kapslen består af gentagne glucuronoxylomannan og glucoronoxylomannangalactan polymerer og funktioner som en beskyttende barriere mod faktorer såsom miljømæssige stress og vært immunrespons2.
Selv om størrelsen af den cryptococcal polysaccharid kapsel størrelse ikke har konsekvent været forbundet med virulens, er der beviser for, at det er en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Kapsel størrelse er forbundet med meningitis patologi6, kan påvirke makrofag evne til at kontrollere Cryptococcus infektion5, og kan resultere i tab af virulens hvis fraværende8. Derfor kapsel størrelse målinger er almindelige i cryptococcal forskning, men der er ingen fieldwide standard for en metode til kapsel måling.
I øjeblikket, C. neoformans polysaccharid kapsel målingen er baseret på manuelle målinger af mikroskopi billeder, og de nøjagtige metoder til både billede og måling erhvervelser varierer mellem laboratorier9,10, 11. En umiddelbar bekymring for denne metode er, at nogle undersøgelser kræver erhvervelse af tusindvis af individuelle målinger, som vanskeliggør opretholdelse nøjagtighed og pålidelighed. Desuden, selv når resultaterne er offentliggjort, der er ofte utilstrækkelige beskrivelse af målemetoden. Mange publikationer ikke forklare, hvordan deres målinger blev opnået, hvad brændplanet blev brugt, hvordan de fastlægges tærsklen for kapsel identifikation, uanset om de anvendes radius eller diameter, uanset om de anvendes én måling eller i gennemsnit flere eller andre detaljer. Nogle publikationer eneste stat deres metode som hvilket program blev brugt, f.eks "Adobe Photoshop CS3 blev brugt til at måle cellerne"11. Denne mangel på standardisering og rapportering detaljer kan gøre reproducerbarhed svært hvis ikke umuligt. Forskelle i menneskelige syn, computer lysstyrke, mikroskop indstillinger, slide, belysning, og andre faktorer kan variere ikke bare mellem individer men mellem prøver, mens beregninger baseret på nøgletal af pixelværdier intensitet vil forblive konstante og gældende mellem prøver. Denne teknik blev genereret i forbindelse med at levere en standardiseret, præcis, hurtig og enkel teknik til at måle kapsler størrelser for et felt, hvor der var ingen før.
Som tidligere nævnt, CHT algoritme er veletablerede, og scripts til automatisk at registrere kredse har været skrevet før. Denne metode forbedrer i to områder, hvor andre scripts vil falde kort. Først, blot registrere cirkler er ikke nok, fordi med cryptococcal celler to særskilte kredse skal være registreret i forhold til hinanden. Denne metode specielt registrerer celle organer inden for kapsler, diskriminerer mellem to, og udfører beregninger kun på de relevante organ-kapsel par. For det andet, selv Hvornår følger den samme protokol, forskellige efterforskere vil ende op med forskellige erhvervet billeder. Ved at tillade investigator kontrol over hver algoritme parameter, kan dette værktøj justeres til at matche en bred vifte af anskaffelsesmetoder. Der er ikke behov for en standardiseret anvendelsesområde, målsætning, filter og så videre.
Denne teknik kan umiddelbart anvendes til enhver situation, hvor investigator skal registrere cirkler i et billede at kontrast med deres baggrund. Både cirkler lysere og mørkere end deres baggrund kan registreres, tælles og måles ved hjælp af denne teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Formålet med denne teknik er at give en ensartet, præcis og håndterbare proces for et stort antal polysaccharid kapsel målinger.
Først, en tærskel billede genereres baseret på intensitetsværdierne entydigt beregnes for hvert billede. Derefter, cirkler opdages, baseret på kontrast mellem objekt og baggrund ved hjælp af den veletablerede cirkel Hough Transformation (CHT) algoritme. Endelig opdaget celle kapsler og organer er matchet efter center koordinater og radius størrelse, og dataene er eksporteret til brugeren i et overskueligt regneark.
Fordelene ved denne teknik er enkle, men signifikant. Første, fordi disse beregninger er udført af en algoritme snarere end et menneske både nøjagtighed og pålidelighed er steget. Der er ingen forringelse af nøjagtigheden eller pålideligheden uanset hvor mange prøver analyseres. For det andet etablerer denne tilgang en potentiel standardprocedure for feltet Cryptococcus i stedet for den nuværende situation, hvor kapsel måling varierer efter lab. For det tredje manuelle kapsel målinger er langsomme og monotone, tillader automation hurtige målinger på mange gærceller, der til gengæld letter høj overførselshastighed dataanalyse og stadig mere magtfulde statistik.
De store begrænsninger i denne teknik kommer fra, hvordan funktionerne algoritme. Først, algoritmen vil kun generere cirkler. Mens Cryptococcus celler og deres kapsler tage på en cirkulær morfologi, ville det være vanskeligt at anvende denne teknik med ikke-cirkulært objekt detektion. For det andet på grund af hvordan cirkler er opdaget kan CHT algoritme registrere enorme pseudo cirkler baseret på de ydre kanter af flere klynger cirkler. Dog kan eventuelle forvansket celle organer fanget i pseudo-cirklen nemt opdaget og fjernet fra de resulterende datasæt.
Denne teknik er beregnet til at måle de cirkulære polysaccharid kapsler af Cryptococcus arter baseret på tusch lysfelt mikroskopi; selv om det kunne anvendes på baseret andre kontrast cirkulære objekt målinger.

Billeder er først fremstillet ved mikroskopi af tusch dias ved hjælp af en lysfelt mikroskop kombineret med et kamera (fig. 1A). Det er vigtigt at have cellerne adskilt og i tilstrækkeligt lav befolkningstæthed ikke at overvælde synsfelt, samt at bruge nok plet for at skabe kontrast mellem celler og baggrund. Som det fremgår af protokollen, vil det nøjagtige antal celler for en optimal billede variere afhængigt af prøven, mikroskop o...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatiseret måling af Cryptococcal arter polysaccharid kapsel og cellen kroppen

Denne teknik beskriver en automatiseret batch image processor designet til at måle polysaccharid kapsel og krop radier. Mens oprindeligt designet til Cryptococcus neoformans kapsel målinger automatiseret Billedbehandler kan også anvendes på andre kontrast baseret detektion af cirkulære objekter.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatiseret Cell Berigelse af cytomegalovirus-specifikke T-celler til kliniske applikationer ved hjælp af Cytokin-capture system

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Meget følsom analyse for måling af arenavirus-celle Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Celle-fri biokemiske fluorometriske enzymatisk Assay for høj overførselshastighed måling af Lipid fedtstoffer i High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Måling af kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Musen krop temperaturmåling ved hjælp af infrarøde termometer under passiv systemisk anafylaksi og mad allergi evaluering

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af antistoffer fra samme art til at studere Host-Patogen interaktioner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time kvantificering af reaktive iltarter i neutrofiler inficeret med meningitiske Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...