Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Wij willen erkennen Anthony Bowen waarvan dia's werden gebruikt als een tweede menselijke side-by-side vergelijking evenals Sabrina Nolan waarvan dia's werden gebruikt als een derde menselijke side-by-side en de tweede vergelijking van de Microscoop.

1. voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia
<ol><li>Pipetteer 10 µL van cryptococcal monster in een dia verschijnt. Een circulaire giststam zal werken maar voor dit experiment H99 was de enige spanning gebruikt. Opmerking: Als het monster rechtstreeks van de voedingsbodems is, verdunnen 1:2 met PBS of water kan helpen voorkomen dat de Oost-Indische inkt uit clumping.</li>
	<li>Pipetteer 2 µL van de Oost-Indische inktvlek op het monster en meng door fysiek duwen van het uiteinde van de pipet om het monster en in...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

De kritische fasen van deze techniek zijn voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia en de Microscoop afbeeldingen ophalen. Terwijl het algoritme met succes met een verscheidenheid van dia en beeld technieken getest is wordt het aanbevolen protocol beschreven in dit manuscript. De polysaccharide capsule wordt gedetecteerd op basis van de uitsluiting van de Oost-Indische inkt deeltjes uit het domein van de capsule zoals deze deeltjes zijn te groot om door te dringen de polysacharide fibril netwerk. Oost-Indische inkt uit...

Cryptococcus neoformans is een pathogene gist overal gevonden over de hele wereld dat is gekoppeld aan ziekten bij de mens vooral in immunosuppressie populaties. C. neoformans is vooral goed voor een beduidende oorzaak is van de totale jaarlijkse sterfgevallen in sub-Saharisch Afrika als gevolg van besmettelijke ziekte1. De belangrijke klinische manifestatie van cryptococcal infectie is meningo, die invasie van het centrale zenuwstelsel door vervoer in besmette macrophages (Trojaans paard wijze volgt) of directe overschrijding van de bloed - hersenbarrière. C. neoformans spreekt verschillende virulentiefactoren waaronder de mogelijkheid om te repliceren op menselijke lichaamstemperatuur, ureaseactiviteit, melanization en vorming van een polysaccharide capsule2. De polysaccharide capsule bestaat uit herhalende glucuronoxylomannan en glucoronoxylomannangalactan polymeren en functies als een beschermende barrière tegen factoren, zoals milieudruk en host immuunrespons op2.
Hoewel de grootte van de cryptococcal polysaccharide capsule grootte niet consequent gekoppeld aan de virulentie heeft, is er bewijs dat er een factor in de pathogenese2,3,4,5, 6,7. Capsule grootte is gekoppeld aan meningitis pathologie6, kan invloed uitoefenen op macrophage Cryptococcus infectie5controle, en kan resulteren in verlies van virulentie als afwezig8. Vandaar, capsule grootte metingen zijn gebruikelijk in cryptococcal onderzoek, maar er bestaat geen fieldwide standaard voor een methode voor de meting van de capsule.
Momenteel, C. neoformans polysaccharide capsule waardering is gebaseerd op handmatige metingen van microscopie beelden, en de exacte methoden van zowel de afbeelding als de meting acquisities variëren tussen laboratoria9,10, 11. Een directe zorg aan deze methode is dat sommige studies vereisen de verwerving van duizenden afzonderlijke metingen, waardoor handhaving nauwkeurigheid en betrouwbaarheid moeilijk. Bovendien, zelfs wanneer de resultaten worden gepubliceerd, er is vaak onvoldoende beschrijving van de meetmethode. Vele publicaties niet uitleggen hoe hun metingen werden verkregen, wat brandvlak werd gebruikt, hoe zij vastbesloten de drempel voor de identificatie van de capsule, of ze gebruikt RADIUS- of diameter, of ze een meting gebruikt of gemiddeld aantal, of andere Details. Sommige publicaties alleen staat hun methode als welk programma is gebruikt, bijvoorbeeld "Adobe Photoshop CS3 werd gebruikt voor het meten van de cellen"11. Dit gebrek aan standaardisatie en rapportage van detail kan maken reproduceerbaarheid moeilijk zo niet onmogelijk. Verschillen in menselijk gezichtsvermogen, computer helderheid, Microscoop instellingen, schuif de verlichting, en andere factoren kunnen variëren niet alleen tussen individuen, maar ook tussen de monsters, overwegende dat de berekeningen op basis van ratio's van pixelwaarden intensiteit constant zal blijven en toepassing tussen de monsters. Deze techniek werd gemaakt in het kader van het verstrekken van een gestandaardiseerde, nauwkeurige, snelle en eenvoudige techniek voor het meten van capsules maten voor een veld waarin er geen vóór was.
Zoals eerder vermeld, de CHT-algoritme is reeds lang gevestigde, en scripts automatisch detecteert cirkels zijn geschreven vóór. Deze methode verbetert in twee gebieden waar andere scripts zou tekortkomen. Eerst, simpelweg het opsporen van cirkels is niet genoeg, omdat met cryptococcal cellen twee verschillende cirkels ten opzichte van elkaar moeten worden gedetecteerd. Deze methode specifiek detecteert cel organen binnen capsules, discrimineert tussen de twee, en berekeningen alleen op de relevante instantie-capsule paren. Ten tweede, zelfs wanneer na de hetzelfde protocol, de verschillende onderzoekers zullen eindigen met verschillende verworven beelden. Doordat de onderzoeker controle over elk algoritme-parameter, kan deze tool worden aangepast aan een breed scala van overname methoden. Er is geen behoefte aan een gestandaardiseerde toepassingsgebied, doelstelling, filter, enzovoort.
Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op elke situatie waarin de onderzoeker moet detecteren cirkels binnen een afbeelding die contrast met hun achtergrond. Beide cirkels lichter en donkerder dan hun achtergrond kan worden opgespoord, geteld en gemeten met behulp van deze techniek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Het doel van deze techniek is om te zorgen voor een consistente, nauwkeurige en beheersbaar proces voor grote aantallen polysaccharide capsule metingen.
Ten eerste, een drempel afbeelding is gegenereerd op basis van intensiteitswaarden uniek berekend voor elke afbeelding. Vervolgens worden cirkels gedetecteerd op basis van contrast tussen het object en de achtergrond met behulp van de gevestigde cirkel Hough transformatie (CHT) algoritme. Tot slot de gedetecteerde cel capsules en organen worden vergeleken volgens center coördinaten en RADIUS-grootte en gegevens worden geëxporteerd naar de gebruiker in een beheersbare werkblad.
De voordelen van deze techniek zijn eenvoudige maar belangrijke. Eerste, omdat deze berekeningen worden uitgevoerd door een algoritme in plaats van een mens zowel de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid zijn verhoogd. Er is geen achteruitgang in de nauwkeurigheid of betrouwbaarheid ongeacht hoeveel monsters worden geanalyseerd. Ten tweede, deze aanpak stelt een potentiële standaard gebruiksprocedure voor het Cryptococcus veld in plaats van de huidige situatie waar capsule meting per lab verschilt. Ten derde, gezien het feit dat handmatige metingen van de capsule zacht en monotoon, automatisering kunt snelle metingen op grote aantallen van gistcellen die op zijn beurt vergemakkelijkt hoge doorvoer data-analyse en steeds krachtiger statistieken.
De belangrijkste beperkingen van deze techniek vandaan hoe het algoritme-functies. Ten eerste zal het algoritme alleen genereren cirkels. Hoewel Cryptococcus cellen en hun capsules over een circulaire morfologie nemen, zou het moeilijk om deze techniek van toepassing op niet-cirkelvormige object detectie. Ten tweede, als gevolg van hoe cirkels worden gedetecteerd de CHT-algoritme kan detecteren enorme pseudo-cirkels op basis van de buitenste randen van verschillende geclusterde cirkels. Echter kan een verdraaid cel organen gevangen binnen de pseudo-cirkel gemakkelijk worden gedetecteerd en verwijderd uit het resulterende gegevenssets.
Deze techniek is bedoeld voor het meten van de circulaire polysaccharide capsules van Cryptococcus soorten op basis van de Oost-Indische inkt helder veld microscopie; Hoewel het kan worden toegepast op andere contrast gebaseerd circulaire object metingen.

Beelden worden eerst verkregen door microscopie van Oost-Indische inkt dia's met behulp van een heldere veld Microscoop in combinatie met een camera(Figuur 1). Het is belangrijk dat cellen gescheiden en in voldoende lage dichtheid niet te overweldigen de gezichtsveld, alsmede over voldoende vlek kunt maken van contrast tussen cellen en achtergrond. Zoals in het protocol, zal het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding variëren afha...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam

Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Muis lichaamstemperatuurmeting met behulp van Infrarood Thermometer tijdens passieve systemische anafylaxie en voedsel allergie evaluatie

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...