Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne Anthony Bowen lysbilder som ble brukt som en andre menneskelige side-ved-side-sammenligning samt Sabrina Nolan lysbilder som ble brukt som en tredje menneskelige side-ved-side og andre mikroskop sammenligning.

1. forberedelse tusj lysbilde
<ol><li>Pipetter 10 µL av cryptococcal prøve på et lysbilde. Sirkulær gjær belastning fungerer, men for dette eksperimentet H99 var bare påkjenningen brukes. Merk: Hvis prøven direkte fra kultur medier, fortynne 1:2 med PBS eller vann kan forhindre India blekk klumper.</li>
	<li>Pipetter 2 µL av blekk flekken på prøven og bland ved fysisk presser pipette spissen til prøven og flytte i en sirkulær bevegelse til India blekk vises jevnt fordelt.</li>
	<li>Plass en dekkglassvæs...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

De avgjørende skritt i denne teknikken er forbereder tusj lysbildet og anskaffe mikroskop-bildene. Mens algoritmen har blitt testet med en rekke lysbilde og bildet er det anbefalte protokollen beskrevet i dette manuskriptet. Polysakkarid kapsel oppdages basert på utelukkelse av blekk partikler fra domenet av kapselen som disse partiklene er for store til å trenge polysakkarid fibril nettverket. Tusj utelukkelse resulterer i en lyse sirkel på en mørk bakgrunn. Algoritmen merker sirkler basert på hvor godt de kontras...

Cryptococcus neoformans er en sykdomsfremkallende gjær funnet overalt rundt om i verden som er tilknyttet for menneskelig sykdom i svekket immunapparat populasjoner. C. neoformans særlig utgjør en vesentlig årsak til totale årlige dødsfall i Sahara på grunn av infeksjonssykdommer1. Store klinisk manifestasjonen av cryptococcal infeksjon er meningoencefalitt, som følger invasjonen av sentralnervesystemet av transport i infiserte makrofager (trojansk hest måte) eller direkte krysset av blod - hjerne barrieren. C. neoformans uttrykker virulens-faktorer som inkluderer evnen å replikere på menneskekroppen temperatur, urease aktivitet, melanization og dannelsen av en polysakkarid kapsel2. Polysakkarid kapsel består av gjentatte glucuronoxylomannan og glucoronoxylomannangalactan polymerer og funksjoner som en beskyttende barriere mot kjønnsbasert miljøbelastning og vert immunreaksjoner2.
Selv om størrelsen på cryptococcal polysakkarid kapsel størrelsen ikke konsekvent er knyttet til virulens, er det bevis for at det er en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Kapsel størrelse er forbundet med meningitt patologi6, kan påvirke macrophage muligheten til å kontrollere Cryptococcus infeksjon5og kan resultere i tap av virulens hvis fraværende8. Derfor kapsel størrelse mål er vanlig i cryptococcal forskning, men det er ingen fieldwide standard for en metode for kapsel måling.
Foreløpig C. neoformans polysakkarid kapsel måling er basert på manuelle målinger av mikroskopi bilder og eksakt metodene av både bilde og mål oppkjøp variere laboratorier9,10, 11. En umiddelbar bekymring til denne metoden er at noen studier krever oppkjøpet av enkeltmål, som gjør opprettholde nøyaktigheten og påliteligheten vanskelig. Videre selv når resultatene er publisert, er det ofte utilstrekkelig beskrivelse av metoden måling. Mange publikasjoner ikke forklare hvordan deres mål ble oppnådd, hva fokalplanet ble brukt, hvordan de bestemmes terskelen for kapsel identifikasjon, om de brukte radius eller diameter, enten de brukes ett mål eller gjennomsnitt flere eller andre detaljer. Noen publikasjoner eneste staten sin metode som hvilket program som ble brukt, f.eks "Adobe Photoshop CS3 ble brukt til å måle cellene"11. Denne mangelen på standardisering og rapportering detaljer kan gjøre reproduserbarhet vanskelig om ikke umulig. Forskjeller i menneskelige syn, datamaskin lysstyrke, mikroskop innstillinger, skyv belysning og andre faktorer kan variere ikke bare mellom individer, men mellom prøvene, mens beregninger basert på prosenter av bildepunktverdier intensitet forblir konstant og gjeldende mellom eksempler. Denne teknikken ble generert i sammenheng med gir en standardisert, nøyaktig, rask og enkel metode for å måle kapsler størrelser for et felt der var det ingen før.
Som tidligere nevnt, CHT algoritmen er veletablert og skript automatisk merker sirkler har blitt skrevet før. Denne metoden øker i to områder der andre skript ville bommer. Først bare oppdage sirkler er ikke nok, fordi to forskjellige sirkler må registreres med cryptococcal celler, i forhold til hverandre. Denne metoden spesielt oppdager cellen legemer i kapsler, diskriminerer mellom to, og utfører beregninger på relevante kroppen-kapsel parene. Andre, selv når etter den samme protokoll, ulike etterforskere vil ende opp med forskjellige kjøpt bilder. Ved at etterforsker kontroll over enhver algoritmen parameter, kan dette verktøyet justeres for å matche en rekke anskaffelsesmetoder. Det er ikke behov for en standardisert omfang, mål, filtrere og så videre.
Denne teknikken kan lett brukes på enhver situasjon som etterforskeren må merker sirkler i et bilde som kontrast med sin bakgrunn. Begge sirkler lysere og mørkere enn deres bakgrunn kan registreres, telles og målt ved hjelp av denne teknikken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Formålet med denne teknikken er å gi en konsekvent, nøyaktig og håndterlig prosess for store tall av polysakkarid kapsel målinger.
Først er en terskel bildet generert basert på intensitetsverdiene unikt beregnes for hvert bilde. Deretter oppdages sirkler basert på kontrast mellom objekt og bakgrunnen med veletablerte sirkel Hough transformasjon (CHT) algoritmen. Endelig oppdaget celle kapsler og organer matches center koordinater og radius størrelse, og dataene eksporteres til brukeren i et håndterlig regneark.
Fordelene med denne teknikken er enkelt men betydelig. Først, fordi disse beregningene utføres av en algoritme i stedet for et menneske både nøyaktighet og pålitelighet er økt. Det er ingen nedgang i nøyaktighet eller pålitelighet uansett hvor mange eksempler er analysert. Andre etablerer denne tilnærmingen en potensiell standard prosedyre for feltet Cryptococcus i stedet for dagens situasjon der kapsel måling varierer av lab. Tredje, gitt at manuelle kapsel målinger er langsom og ensformig, automatisering kan rask målene på store mengder gjærceller som igjen muliggjør høy gjennomstrømning dataanalyse og stadig kraftigere statistikk.
De store begrensningene av denne teknikken kommer fra hvordan funksjonene algoritme. Først genererer algoritmen bare sirkler. Mens Cryptococcus celler og deres kapsler tar på en sirkulær morfologi, ville det være vanskelig å bruke denne teknikken til ikke-sirkulært objekt gjenkjenning. Andre, på grunn av hvordan sirkler oppdages CHT algoritmen kan oppdage enorme pseudo sirkler basert på ytre kant av flere gruppert sirkler. Men kan noen uriktig fremstilling cellen legemer fanget i pseudo sirkelen lett oppdaget og fjernet fra de resulterende datasettene.
Denne teknikken er ment for å måle sirkulær polysakkarid kapsler Cryptococcus arter basert på tusj lyse feltet mikroskopi; men det kan brukes til basert andre kontrast sirkulær objektet målinger.

Bilder er første oppnås ved mikroskopi tusj lysbilder med lyse feltet mikroskop kombinert med et kamera (figur 1A). Det er viktig å ha celler atskilt og tilstrekkelig lav tetthet ikke å overvelde synsfelt, samt å bruke nok flekken for å skape kontrast mellom bakgrunnen og celler. Som nevnt i protokollen, vil antallet celler for et optimalt bilde variere avhengig av prøven, mikroskop og målet som brukes. De viktige aspektene er å sikr...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatisert måling av Cryptococcal arter polysakkarid kapsel og celle kroppen

Denne teknikken beskriver en automatisert bakst image prosessor designet for å måle polysakkarid kapsel og kroppen radier. Mens opprinnelig utformet for Cryptococcus neoformans kapsel målinger automatisert bildeprosessoren kan også brukes til andre kontrast basert påvisning av sirkulære objekter.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatisert Cell anrikning av Cytomegalovirus-spesifikke T-celler for kliniske applikasjoner ved hjelp av cytokin-fangst System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Svært sensitiv analyse for måling av arenavirus-celle vedlegg

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cell-free biokjemiske Fluorometric enzymatisk analysen for høy gjennomstrømming-måling av Lipid Peroxidation in høy tetthet Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Måling av kapselen Diameter i Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Musen måling av kroppstemperatur bruke infrarød termometer under passiv systemisk anafylaksi og mat allergi evaluering

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dobbel merking av immunfluorescens ved hjelp av antistoffer fra samme art for å studere vertspatogeninteraksjoner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Sanntids kvantifisering av reaktive oksygenarter i nøytrofiler smittet med meningittisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...