Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Nós gostaríamos de reconhecer Anthony Bowen cujos slides foram usados como uma segunda comparação lado-a-lado humana, bem como Sabrina Nolan cujos slides foram usados como um terceiro lado-por-lado humano e segundo microscópio de comparação.

1. preparação de tinta nanquim Slide
<ol><li>Pipete 10 µ l de amostra criptocócica numa lâmina. Qualquer levedura circular irá funcionar, mas para este experimento H99 foi a única estirpe utilizada. Nota: Se a amostra for directamente a partir de meios de cultura, diluição 1:2 com PBS ou água pode ajudar a prevenir a tinta da Índia de aglutinação.</li>
	<li>Pipetar 2 µ l de mancha de tinta da Índia para a amostra e misture fisicamente empurrando a ponta da pipeta para a amostra e movendo-se em movimen...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Os passos críticos desta técnica estão preparando o slide de tinta nanquim e aquisição de imagens do microscópio. Enquanto o algoritmo foi testado com êxito com uma variedade de técnicas de slide e imagem o protocolo recomendado é descrito neste manuscrito. A cápsula de polissacarídeo é detectada com base na exclusão de partículas de tinta da Índia do domínio da cápsula como estas partículas são muito grandes para penetrar a rede de fibrila de polissacarídeo. Exclusão de Nanquim resulta em um círcul...

Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica ubiquitously encontrada ao redor do globo que está associado com doença humana principalmente em populações de imunossuprimidos. C. neoformans mais notavelmente representa uma importante causa de mortes anuais totais na África subsahariana devido a doenças infecciosas1. A principal manifestação clínica de infecção criptocócica é meningoencefalite, que segue a invasão do sistema nervoso central de transportes em macrófagos infectados (forma de cavalo de Troia) ou cruzamento direto da barreira sangue - cérebro. C. neoformans manifesta vários fatores de virulência, incluindo a capacidade de replicar na temperatura do corpo humano, a atividade da urease, melanização e formação de uma cápsula de polissacarídeo2. A cápsula de polissacarídeo é composta de repetição glucuronoxylomannan e glucoronoxylomannangalactan de polímeros e funções como uma barreira protetora contra fatores como estresse ambiental e de respostas imunes do hospedeiro2.
Embora o tamanho do tamanho da cápsula de polissacarídeo criptocócica não foi consistentemente associado com virulência, há provas de que é um fator na patogênese2,3,4,5, 6,7. Cápsula tamanho está associado a meningite patologia6, pode afetar a capacidade de macrófago para controlar a infecção de Cryptococcus 5e pode resultar em perda de virulência se ausente8. Daí, medições do tamanho da cápsula são comuns em pesquisa criptocócica, mas não há nenhum fieldwide padrão para um método de medição da cápsula.
Atualmente, c. neoformans polissacarídeo cápsula medida baseia-se na medição manual de imagens de microscopia, e os métodos exatos de aquisições tanto imagem e medição variam entre laboratórios9,10, 11. Uma preocupação imediata para este método é que alguns estudos exigem a aquisição de milhares de medições individuais, o que torna difícil a manutenção de precisão e confiabilidade. Além disso, mesmo quando os resultados são publicados, lá é muitas vezes insuficiente descrição do método de medição. Muitas publicações não explicam como foram obtidas as medidas, utilizou-se o que plano focal, como determinado o limiar para identificação da cápsula, se eles usaram o raio ou o diâmetro, eles utilizado uma medição ou a média de vários, ou outros detalhes. Algumas publicações único Estado seu método como qual programa foi usado, por exemplo, "Adobe Photoshop CS3 foi usado para medir as células"11. Esta falta de padronização e relatando detalhes pode dificultar a reprodutibilidade se não impossível. Diferenças na visão humana, brilho do computador, configurações do microscópio, deslize a iluminação, e outros fatores podem variar não só entre indivíduos, mas entre as amostras, Considerando que cálculos baseados em proporções de valores de intensidade do pixel permanecerá constantes e aplicáveis entre as amostras. Esta técnica foi gerada no contexto de fornecer uma técnica padronizada, precisa, rápida e simples para medir tamanhos de cápsulas para um campo em que não havia nenhum antes.
Como mencionado anteriormente, o algoritmo CHT é bem estabelecida, e scripts para detectar automaticamente os círculos foram escritos antes. Esse método melhora em duas áreas onde outros scripts que ficam aquém. Em primeiro lugar, simplesmente detectar círculos não é suficiente, porque com células criptocócica devem ser detectados dois círculos distintos em relação à outra. Esse método especificamente detecta corpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre os dois e realiza cálculos apenas sobre os pares de corpo-cápsula relevantes. Em segundo lugar, mesmo quando seguir o mesmo protocolo, diferentes investigadores vai acabar com diferentes adquiridas imagens. Permitindo o controle do investigador sobre cada parâmetro de algoritmo, esta ferramenta pode ser ajustada para coincidir com uma ampla gama de métodos de aquisição. Não há nenhuma necessidade para um escopo padronizado, objetivo, filtro e assim por diante.
Esta técnica pode ser aplicada facilmente a qualquer situação em que o investigador precisa detectar círculos dentro de uma imagem que contrastam com o fundo. Ambos os círculos mais leves e mais escuros do seu plano de fundo pode ser detectado, contados e medidos usando esta técnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

O objetivo desta técnica é fornecer um processo consistente, preciso e gerenciável para grande número de medições da cápsula de polissacarídeo.
Primeiro, uma imagem de limiar é gerada com base nos valores de intensidade calculados exclusivamente para cada imagem. Em seguida, círculos são detectados com base no contraste entre o objeto e o plano de fundo usando o algoritmo de transformação de Hough de círculo (CHT) bem estabelecida. Finalmente, a célula detectado cápsulas e corpos são comparados de acordo com o tamanho do raio e as coordenadas do centro, e dados são exportados para o usuário em uma planilha gerenciável.
As vantagens desta técnica são simples, mas significativo. Primeiro, porque esses cálculos são executados por um algoritmo, ao invés de um ser humano tanto a precisão e a confiabilidade são aumentadas. Não há nenhuma diminuição na precisão ou confiabilidade independentemente de quantas amostras são analisadas. Em segundo lugar, esta abordagem estabelece um potencial o procedimento padrão para o campo de Cryptococcus em vez da situação atual onde cápsula medição varia de acordo com o laboratório. Em terceiro lugar, dado que a medição manual da cápsula é lentas e monótonas, automação permite medições rápidas em um grande número de células de levedura que por sua vez facilita a análise de dados de alta taxa de transferência e estatísticas cada vez mais poderosas.
As principais limitações desta técnica vem como as funções do algoritmo. Em primeiro lugar, o algoritmo só irá gerar círculos. Enquanto as células Cryptococcus e suas cápsulas assumem uma morfologia circular, seria difícil aplicar esta técnica para detecção de objeto não-circular. Em segundo lugar, devido a como os círculos são detectados o algoritmo CHT pode detectar enormes círculos pseudo baseados-se nas bordas exteriores de vários círculos em cluster. No entanto, qualquer deturpados corpos celulares, pego dentro do círculo de pseudo podem ser facilmente detectados e removidos os conjuntos de dados resultantes.
Esta técnica é destinada a medir as cápsulas circulares polissacarídeo de espécies de Cryptococcus baseado em microscopia de campo claro tinta nanquim; Embora poderia ser aplicada para outro contraste com base em medições objeto circular.

Imagens primeiro são obtidas pela microscopia de Nanquim slides usando um microscópio de campo claro, juntamente com uma câmera (Figura 1A). É importante que as células separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão, bem como como usar bastante mancha para criar contraste entre células e plano de fundo. Conforme o protocolo, o número exato de células para uma óptima imagem irá variar depende...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Imunologia e Infecção

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Medição de temperatura de corpo do mouse usando o termômetro infravermelho durante passiva anafilaxia sistêmica e avaliação de alergia alimentar

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...