Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
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Nos gustaría reconocer Anthony Bowen cuyas diapositivas fueron utilizados como una segunda comparación de lado a lado humana como Sabrina Nolan cuyas diapositivas fueron utilizados como un tercer humano side-by-side y segunda comparación del microscopio.

1. preparación de portaobjetos de tinta de la India
<ol><li>Pipetear 10 μl de muestra cryptococcal en un portaobjetos. Cualquier cepa de levadura circular funcionará pero para este experimento H99 era la única tensión que utiliza. Nota: Si la muestra es directamente en medios de cultivo, diluir 1:2 con PBS o agua puede ayudar a evitar que la tinta de la India de agrupar.</li>
	<li>Pipetear 2 μl de mancha de tinta de la India sobre la muestra y mezclar físicamente empujando la punta de la pipeta a la muestra y...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Los pasos críticos de esta técnica son preparar el carro de tinta de la India y adquiriendo las imágenes de microscopio. Mientras que el algoritmo ha sido probado con éxito con una variedad de técnicas de imagen y diapositiva en este manuscrito se describe el protocolo recomendado. La cápsula polisacárida es detectada basado en la exclusión de partículas de tinta de la India del dominio de la cápsula de estas partículas son demasiado grandes para penetrar la red fibrilar de polisacárido. Exclusión de la tint...

Cryptococcus neoformans es una levadura patógena encontrada ubicuo alrededor del mundo que se asocia a enfermedad humana, sobre todo en las poblaciones de inmunodeprimidos. C. neoformans en particular representa una causa significativa del total de muertes anual en el África subsahariana debido a enfermedades infecciosas1. La principal manifestación clínica de la infección cryptococcal es meningoencefalitis, que sigue la invasión del sistema nervioso central por transporte en macrófagos infectados (forma de caballo de Troya) o cruce directo de la barrera blood - brain. C. neoformans expresa varios factores de virulencia, incluyendo la capacidad de replicar en la temperatura del cuerpo humano, actividad de la ureasa, melanization y formación de una cápsula de polisacárido2. La cápsula de polisacárido se compone de glucuronoxylomannan y polímeros glucoronoxylomannangalactan y funciones de repetición como una barrera protectora contra factores de estrés ambiental como anfitrión inmunorespuestas2.
Aunque el tamaño del tamaño de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus no siempre se ha asociado con virulencia, hay evidencia de que es un factor en la patogenesia2,3,4,5, 6,7. Tamaño de la cápsula se asocia a meningitis patología6puede afectar la capacidad del macrófago para control de infección por Cryptococcus 5y puede resultar en la pérdida de virulencia si ausente8. Por lo tanto, las mediciones de tamaño de la cápsula son comunes en la investigación de Cryptococcus, pero no hay fieldwide estándar para un método de medición de cápsulas.
Actualmente, C. neoformans polisacárido cápsula medición se basa en mediciones manuales de imágenes de microscopia y los métodos exactos de imagen y medición adquisiciones varían de laboratorios9,10, 11. Una preocupación inmediata para este método es que algunos estudios requieren la adquisición de miles de mediciones individuales, lo que dificulta mantener precisión y fiabilidad. Además, incluso cuando los resultados se publican, a menudo hay insuficiente Descripción de los métodos de medición. Muchas publicaciones no explican cómo obtuvieron sus mediciones, qué plano focal fue utilizado, cómo determina el umbral para la identificación de la cápsula, si usaron radio o diámetro, si se utiliza una medición o un promedio de varios, o de otro detalles. Algunas publicaciones sólo estado su método como programa que se utilizó, por ejemplo, "Adobe Photoshop CS3 se utilizó para medir las células"11. Esta falta de estandarización y presentación de informes detalle puede hacer reproducibilidad difícil si no imposible. Diferencias en la vista humana, brillo de la computadora, configuración del microscopio, deslice la iluminación y otros factores pueden variar no sólo entre individuos sino entre las muestras, mientras que cálculos basados en relaciones de los valores de intensidad del píxel permanece constantes y aplicable entre muestras. Esta técnica fue generada en el contexto de proporcionar una técnica estandarizada, precisa, rápida y simple para medir tamaños de cápsulas para un campo en el que hubo antes.
Como se mencionó anteriormente, el algoritmo de la CHT es larga, y se han escrito scripts para que detecte automáticamente círculos antes. Este método mejora en dos áreas donde otros scripts le quedan cortos. En primer lugar, detectar simplemente círculos no es suficiente, porque con las células de Cryptococcus deben detectarse dos círculos distintos en relación con cada uno otro. Este método específicamente detecta cuerpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre los dos y realiza cálculos sólo en los correspondientes pares de cápsula de cuerpo. En segundo lugar, incluso cuando siguiendo el mismo protocolo, diferentes investigadores acabará con diferentes adquirió imágenes. Permitiendo el control del investigador sobre cada parámetro del algoritmo, esta herramienta se puede ajustar para que coincida con una amplia gama de métodos de adquisición. No hay necesidad para un alcance estándar, objetivo, filtro y así sucesivamente.
Esta técnica se puede aplicar fácilmente a cualquier situación en la que el investigador necesita detectar círculos dentro de una imagen que contrasta con su fondo. Ambos círculos más claros y más oscuros que su fondo puede ser detectada, contados y medidos con esta técnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

El propósito de esta técnica es proporcionar un proceso manejable, preciso y consistente de un gran número de mediciones de cápsula de polisacárido.
En primer lugar, se genera una imagen de umbral basado en valores de intensidad única calculados para cada imagen. Entonces, círculos son detectados basados en el contraste entre el objeto y el fondo usando el algoritmo de transformación de Hough de círculo (CHT) bien establecido. Finalmente, las cápsulas detectado células y órganos se corresponden según el centro de coordenadas y el tamaño de radio, y los datos se exportan al usuario en una hoja de cálculo manejable.
Las ventajas de esta técnica son simples pero significativos. Primero, porque estos cálculos son realizados por un algoritmo en lugar de un humano se aumentan la precisión y fiabilidad. No hay ninguna disminución de la exactitud o confiabilidad independientemente de cuántas muestras se analizan. En segundo lugar, este enfoque establece un potencial procedimiento de funcionamiento estándar para el campo de Cryptococcus en lugar de la situación actual donde medida cápsula varía según el laboratorio. En tercer lugar, dado que las mediciones cápsulas manual lento y monótono, automatización permite realizar mediciones rápidas en gran número de células de levadura que a su vez facilita el análisis de datos de alto rendimiento y estadísticas cada vez más potentes.
Las principales limitaciones de esta técnica provienen de cómo las funciones del algoritmo. En primer lugar, el algoritmo generará sólo círculos. Mientras que las células de Cryptococcus y sus cápsulas en una morfología circular, sería difícil aplicar esta técnica para detección de objetos no circular. En segundo lugar, debido a cómo se detectan los círculos el algoritmo CHT puede detectar enormes círculos pseudo basados en los bordes exteriores de varios círculos agrupados. Sin embargo, cualquier tergiversados cuerpos celulares dentro del círculo pseudo fácilmente detectados y eliminados de los conjuntos de datos resultantes.
Esta técnica se significa para medir las cápsulas circular polisacárido de Cryptococcus especie basado en microscopía de campo brillante de tinta de la India; Aunque se podría aplicar a otros contraste realiza las mediciones del objeto circular.

Primero se obtienen las imágenes por microscopia de diapositivas, tinta de la India utilizando un microscopio de campo brillante, juntado con una cámara (figura 1A). Es importante que las células separadas y en la densidad suficientemente baja no para abrumar el campo de visión, así como utilizar suficiente mancha para crear contraste entre las células y el fondo. Como se indica en el protocolo, el número exacto de las células para un...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus especies y cuerpo de la célula

Esta técnica describe un procesador de imágenes por lotes automatizado diseñado para medir radios de cuerpo y cápsula de polisacárido. Si bien inicialmente diseñado para las mediciones cápsulas Cryptococcus neoformans , que el procesador de imagen automatizado puede aplicarse también a otros detección de contraste basado de objetos circulares.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

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