Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Vi skulle vilja erkänna Anthony Bowen vars bilder användes som andra mänskliga sida-vid-sida jämförelse samt Sabrina Nolan vars bilder användes som en tredje mänskliga sida-vid-sida och andra Mikroskop jämförelse.

1. beredning av India färgpulver bild
<ol><li>Pipettera 10 µL av cryptococcal prov på ett objektglas. Alla cirkulär jästsort fungerar men för detta experiment H99 var den enda stam som används. Obs: Om provet är direkt från kultur media, spädning 1:2 med PBS eller vatten kan förhindra tusch klumpar.</li>
	<li>Pipettera 2 µL av Indien bläck fläcken på provet och blanda genom fysiskt driver pipettspetsen till provet och flytta i en cirkulär rörelse tills Indien bläck visas jämnt fördelade.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

De kritiska steg med denna teknik förbereder i India färgpulver bilden och förvärva Mikroskop bilderna. Medan algoritmen har framgångsrikt testats med en mängd olika bild och bild tekniker beskrivs rekommenderade protokollet i detta manuskript. Polysackarid kapseln upptäcks baserat på uteslutandet av Indien bläckpartiklar från domänen för kapseln som dessa partiklar är för stora för att tränga igenom polysackarid fibrill nätverket. India färgpulver utslagning resulterar i en ljus cirkel ovanpå en mörk...

Cryptococcus neoformans är en patogen jäst hittade ubiquitously i världen som är associerad med mänskliga sjukdomen primärt hos immunsupprimerade populationer. C. neoformans framför står för en betydande orsak till totala årliga dödsfall i subsahariska Afrika på grund av smittsam sjukdom1. Den stora kliniska manifestationen av cryptococcal infektion är meningoencefalit, som följer invasion av centrala nervsystemet av transport i infekterade makrofagerna (trojansk häst sätt) eller direkt korsning av den blod - hjärnbarriären. C. neoformans uttrycker flera virulensfaktorer inklusive möjligheten att replikera på människans kroppstemperatur, ureasaktivitet, melanization och bildandet av en polysackarid kapsel2. Polysackarid kapseln består av upprepade glucuronoxylomannan och glucoronoxylomannangalactan polymerer och funktioner som en skyddande barriär mot faktorer som stress och värd immunsvar2.
Även om storleken på cryptococcal polysackarid kapsel storlek inte konsekvent har associerade med virulens, finns det bevis för att det är en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Storlek är associerad med meningit patologi6, kan påverka makrofag förmåga att styra Cryptococcus infektion5och kan resultera i förlust av virulens om frånvarande8. Därför kapsel storlek mätningar är vanliga i cryptococcal forskning, men det finns ingen fieldwide standard för en kapsel mätmetod.
För närvarande C. neoformans polysackarid kapsel mätningen baseras på manuella mätningar av mikroskopi bilder, och metoderna för både bild och mätning förvärv varierar mellan laboratorier9,10, 11. En omedelbar oro att denna metod är att vissa studier kräver förvärvet av tusentals enskilda mätningar, vilket försvårar att upprätthålla noggrannhet och tillförlitlighet. Dessutom även när resultaten publiceras, finns det ofta otillräcklig Beskrivning av mätmetoden. Många publikationer inte förklara hur deras mätningar erhölls, vilken fokalplan användes, hur de beslutsamma tröskeln för kapsel identifiering, huruvida de använt radie eller diameter, oavsett om de används en mätning eller i genomsnitt flera, eller andra Detaljer. Vissa publikationer endast staten deras metod som vilket program som använts, t.ex., ”Adobe Photoshop CS3 användes för att mäta cellerna”11. Denna brist på standardisering och rapportering detalj kan göra reproducerbarhet svårt om inte omöjligt. Skillnader i människors syn, dator ljusstyrka, Mikroskop inställningar, Skjut belysning och andra faktorer kan varierar inte bara mellan individer utan mellan prover, medan beräkningar baserade på förhållanden av pixel intensitetsvärden förblir konstant och tillämpliga mellan prover. Denna teknik har genererats i samband med att tillhandahålla en standardiserad, korrekt, snabb och enkel teknik för att mäta kapslar storlekar för ett fält där det fanns ingen innan.
Som tidigare nämnts, CHT algoritmen är väletablerad och skript för att automatiskt upptäcka cirklar har skrivits innan. Metoden förbättrar i två områden där andra skript skulle falla kort. Första helt enkelt upptäcka cirklar är inte tillräckligt, eftersom med cryptococcal celler två distinkta cirklar måste upptäckas i förhållande till varandra. Denna metod uttryckligen upptäcker cellen organ inom kapslar, diskriminerar mellan två och utför beräkningar endast på de relevanta organ-kapsel-par. För det andra, även när efter samma protokoll, olika utredare kommer att sluta med olika förvärvade bilder. Genom att låta försöksledaren kontroll över varje algoritm parametern, kan detta verktyg justeras för att passa ett brett spektrum av förvärvsmetoder. Det finns inget behov av en standardiserad omfattning, mål, filter och så vidare.
Denna teknik kan lätt tillämpas på varje situation där utredaren behöver upptäcka cirklar inom en bild som kontrast till deras bakgrund. Både cirklar ljusare och mörkare än deras bakgrund kan upptäckas, räknas och mäts med hjälp av denna teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Syftet med denna teknik är att ge en konsekvent, korrekt och hanterbar process för ett stort antal polysackarid kapsel mätningar.
Först, en tröskel bilden genereras baserat på intensitetsvärden unikt beräknas för varje bild. Sedan, cirklar upptäcks baserat på kontrasten mellan objekt och bakgrund med väletablerade cirkel Hough Transformation (CHT) algoritm. Slutligen de upptäckta cell kapslar och organ matchas enligt center koordinater och RADIUS-storlek och data exporteras till användaren i ett lätthanterligt kalkylblad.
Fördelarna med denna teknik är enkel men betydande. Första, eftersom dessa beräkningar utförs av en algoritm i stället för en människa både noggrannhet och tillförlitlighet ökar. Det finns ingen nedgång i riktigheten eller tillförlitligheten oavsett hur många prover analyseras. För det andra, denna strategi fastställs en potentiell normalförfarande för fältet Cryptococcus i stället för den nuvarande situationen där kapsel mätning varierar av lab. Tredje, med tanke på att manuell kapsel mätningar är långsam och monotona, automation tillåter snabba mätningar på stora mängder jästceller som i sin tur underlättar hög genomströmning dataanalys och allt mäktigare statistik.
Stora begränsningar i denna teknik kommer från hur funktionerna algoritm. Algoritmen kommer först, bara generera cirklar. Medan Cryptococcus celler och deras kapslar tar på en cirkulär morfologi, skulle det vara svårt att tillämpa denna teknik till icke-cirkulära objekt upptäckt. För det andra, på grund av hur cirklar upptäcks CHT algoritmen kan upptäcka enorma pseudo cirklar baserat på ytterkanterna på flera klustrade cirklar. Dock kan någon felaktig bild cell organ som fångas inom pseudo cirkeln enkelt upptäckas och tas bort från de resulterande datauppsättningarna.
Denna teknik är avsedd för mätning av cirkulär polysackarid kapslarna av Cryptococcus arter baserat på India färgpulver ljusa fält mikroskopi; Trots det skulle kunna tillämpas på bygger andra kontrast cirkulär objektet mätningar.

Bilder erhålls först genom mikroskopi av India färgpulver bilder med ljusa fält Mikroskop tillsammans med en kamera (figur 1A). Det är viktigt att ha celler separerade och i tillräckligt låg densitet inte att överväldiga synfält, samt att använda tillräckligt fläcken för att skapa kontrast mellan celler och bakgrund. Som anges i protokollet, kommer att det exakta antalet celler för en optimal bild variera beroende på provet, M...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatiserad mätning av Cryptococcal arter polysackarid kapsel och cellkroppen

Denna teknik beskriver en automatiserad batch bildprocessor avsedd att mäta polysackarid kapsel och kroppen radier. Samtidigt som ursprungligen har utformats för Cryptococcus neoformans kapsel mätningar automatiserade bildprocessorn kan också tillämpas på andra baserat kontrastmätning av cirkulära objekt.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Levande cell imaging av Bacillus subtilis Och Streptococcus pneumoniae Med hjälp av automatiserade Time-lapse Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatiserad cell Anrikning av cytomegalovirus-specifika T-celler för kliniska tillämpningar med hjälp av cytokin-infångningssystemet

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Mycket känslig analys för Mätning av Arenavirus-cellvidhäftning

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Mätning av T-cell alloreaktivitet Använda Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cell-free biokemiska Fluorometric enzymatisk analys för High-throughput mätning av lipidperoxidation i hög Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Mätning av kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Musen kropp temperaturmätning med infraröd termometer under passiva systemisk anafylaxi och mat allergi utvärdering

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Dubbelmärkning av immunofluorescens med antikroppar från samma art för att studera värdpatogeninteraktioner

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Kvantifiering i realtid av reaktiva syrearter i neutrofiler infekterade med meningitisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...