Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Drs. Stephanie Spohn og Basel Abuaita for mange nyttige diskussioner på organoid mikroinjektion. JRS understøttes af Intestinal stamcelle Consortium (U01DK103141), et forskningssamarbejde projekt finansieret af det nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme (NIDDK) og National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID). JRS og VBY understøttes af NIAID roman, alternativ modelsystemer til enteriske sygdomme (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH understøttes mekanismer af mikrobielle patogenese uddannelse tilskud fra det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID, T32AI007528) og klinisk og translationel Science award til Michigan Institut for klinisk og sundhed Forskning (UL1TR000433).
Den fuldstændige datafiler og data analyse kode bruges i dette håndskrift er tilgængelige på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter at videregive.

Denne protokol fastsætter en all-round metode for mikroinjektion af hPSC-afledte HIOs og væv-afledte tarm organoids og måling af epitel barriere permeabilitet i realtid. Vi har også demonstreret vores tilgang til analyse og fortolkning af data genereret ved hjælp af disse metoder. Givet den voksende vedtagelsen af tarm organoids modelsystemer16,20,21,28 og den mangeårige interesse i tarm barriere permeabilitet som en fysiologisk relevante funktionelle resultatet3,4,5,6, vi forventer, at andre, der arbejder på dette område vil være i stand til at anvende og bygge videre på disse metoder.
Der er flere trin, som er afgørende for anvendelsen af denne teknik. Adgang til høj kvalitet hPSC- eller væv afledte HIO væv bør være etableret inden omfattende eksperimenter med mikroinjektion. HIO macrostructure kan være heterogene, med variation i både størrelse og form, selv om væv identitet og cellulære morfologi er yderst reproducerbare når udnytte etableret metode til at generere HIOs24. Kugleformet HIOs bestående af en enkelt semi-transparent lumen og måler ca 1 mm i diameter er ideelle til mikroinjektion og måling af luminale fluorescens i realtid. I nogle tilfælde mislykkes mikroinjektion, resulterer i kollaps af HIO eller indlysende lækage af injicerede materiale. Mislykket HIOs kan fjernes fra kultur godt på brugerens skøn ved hjælp af en standard mikropipette. Overveje mål linser til rådighed på en billeddannelse platform, når du vælger HIOs for mikroinjektion og billedbehandling. Generelt 2-4 X mål linser er ideelle til at indfange et komplet HIO fluorescerende signal, selv om en 10 X mål kan anvendes, hvis lavt strømforbrug objektiver ikke er tilgængelig, eller hvis de tilgængelige HIOs er &#60; 1 mm i diameter. Imaging software skal give mulighed for automatiseret erobringen af fluorescerende billeder på definerede punkter over tid.
Flere ændringer i denne protokol er muligt for at passer til de eksperimentelle krav. For eksempel, barriere funktion testresultater kan være afhængige af den molekylære størrelse af forbindelser i brug43 og det kan være hensigtsmæssigt at teste dextran præparater af varierende molekylvægt. Derudover kan brightfield imaging udføres ud over fluorescens imaging som en indikator for den overordnede strukturelle integritet af væv25. Når du udfører mikroinjektion af levende bakterier25,28,31,32,33,44, kan det være nødvendigt at tilføje penicillin og streptomycin eller gentamicin HIO kultur medierne forud for eller efter mikroinjektion. Ydersiden af microcapillary vil blive forurenet under påfyldning med bakteriekulturen suspension og dette kan overføres til HIO medier. Skiftevis, mikroinjektion kan udføres på HIOs suspenderet i ekstracellulær matrix (fx Matrigel) uden medier, tilføjer mediet efter mikroinjektion er afsluttet. Dette kan begrænse forurening til ekstracellulære matrix og eksterne ansigt af HIO. Når du planlægger mikrobiel vækst assays, kan det være nødvendigt at fjerne antibiotika i medierne efter 1-2 h til at undgå at bremse eller forhindre vækst af microinjected organismer.
Endelig er erkender, at ikke alle forskere vil have adgang til mikroskopi udstyr egnet til in vitro- imaging, det vigtigt at påpege, at de procedurer, der er skitseret i denne protokol for indsamling af fluorescens data kan anvendes på billeder taget på faste timepoints ved hjælp af standard epifluorescerende mikroskopi uden automatiseret billedcapture eller miljøkontrol. Eksempler på denne fremgangsmåde findes i betænkningerne af Leslie og Huang et al. 25, der undersøgte C. difficile toksin aktivitet i hPSC-afledte tarm organoids og Karve og Pradan et al. 44, der undersøgte epitel barriere permeabilitet i lignende hPSC-afledte tarm organoids microinjected med live E. coli. Manuel betjening af imaging udstyr kan resultere i større variation og vanskeligheder med at normalisere den fluorescerende signal. Når udfører manuel billeddannelse af FITC-dextran injiceres HIOs er det afgørende at fastholde fast forstørrelse, fluorescerende excitation intensitet og eksponering gange hele eksperiment at undgå konkurrenceforvridende fluorescerende intensitet målinger.

Den intestinale epitel udgør en selektiv barriere, der medierer retningsbestemt transport af næringsstoffer, H2O, ioner og affaldsprodukter samtidig minimere uspecifik diffusion-medieret udveksling af andre partikler mellem lumen og den mesenchymale væv eller blod levering1,2. Uspecifik permeabilitet af den intestinale epitel barriere har længe været betragtet som en nøgle funktionelle parameter i både sundhed og sygdom3,4,5,6, der afspejler satsen af Diffusion af små molekyler på tværs af epitel via paracellular plads. Måling af epitel barriere permeabilitet kan gennemføres i dyre modeller7 og i menneskelige patienter8 gennem indtagelse af Lose, som har ingen særlige transporter i mave-tarmkanalen, og den efterfølgende indsamling og måling af Lose koncentrationer i perifert blod. Alternative indtaget markører af barriere funktion som fluorescently mærket kulhydrater er også tilgængelige9,10. Denne tilgang er blevet tilpasset for intestinale epitel cellekulturer dyrkes på Transwell understøtter11, en forenklet fremgangsmåde, der giver mulighed for større eksperimentelle kontrol, men er også blevet kritiseret som en dårlig indikator for in vivo permeabilitet på grund af manglen på differentierede epitelial undertyper og væv struktur12. Brug kamre udgør endnu en anden tilgang og mulighed for måling af epitel barriere funktion i hele tarmslimhinden ex vivo13. Anvendelse af denne teknik er ofte begrænset af væv tilgængelighed og betingelse13,14. Dermed er nye metoder, som afbalancere reproducerbarhed og overførselshastighed med fysiologisk relevans nødvendige.
Den seneste udvikling i in vitro- organogenesis har ført til vedtagelsen af 3D vævskultur modelsystemer som en avanceret platform for recapitulating dynamikken i komplekse væv15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Især humane pluripotente stamceller (hPSC) afledt menneskelige tarm organoids (HIOs)19,24 er dukket op som en reproducerbar og eksperimentelt tractable modelsystem til undersøgelse af vært-mikrobielle interaktioner og epitel barriere dynamics25,26,27,28. Tilsvarende menneskelige væv-afledte organoids (også kendt som enteroids) kan være afledt af en simpel biopsi procedure og kan bruges som en tractable system til at studere menneskets fysiologi og sygdomme15,29,30. Mikroinjektion af menneskelige tarm organoids giver mulighed for levering af eksperimentelle forbindelser25 eller live mikrober25,31,32,33 til den apikale epitelial overfladen af organoid lumen. Leslie og Huang et al. 25 tilpasset for nylig denne teknik til at måle barriere permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran efter udsættelse for bakterielle toksiner.
Denne protokol er tænkt som en vejledning til måling af epitel barriere permeabilitet i hPSC-afledte HIOs og væv-afledte HIOs ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Med mindre ændringer, kan det også tjene som en generel primer på mikroinjektion af HIOs med eksperimentelle forbindelser. Brugere kan supplere denne protokol med supplerende eller alternative downstream programmer efter mikroinjektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Fremskridt i 3D kultur af tarmens væv fremstillet gennem biopsi eller genereret fra pluripotente stamceller via styret differentiering, har resulteret i sofistikerede in vitro- modeller af tarmslimhinden. Udnytte disse nye modelsystemer vil kræve tilpasning af værktøjer og teknikker udviklet for 2D kultur systemer og dyr. Her, beskriver vi en teknik til måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm organoids i realtid. Dette opnås ved mikroinjektion af fluorescently mærket dextran og imaging på en inverteret mikroskop udstyret med epifluorescerende filtre. Real-time måling af barriere permeabilitet i tarm organoids letter generation af høj opløsning temporale data i menneskelige intestinale epitel væv, selv om denne teknik kan også anvendes på fast tidspunkt imaging tilgange. Denne protokol kan let tilpasses til måling af epitel barriere permeabilitet efter udsættelse for farmakologiske stoffer, bakteriel produkter eller toksiner eller levende mikroorganismer. Med mindre ændringer, denne protokol kan også tjene som en generel primer på mikroinjektion af tarm organoids og brugere kan vælge at supplere denne protokol med supplerende eller alternative downstream programmer efter mikroinjektion.

HIOs blev differentieret fra humane pluripotente stamceller og kulturperler i celle matrix løsning som tidligere beskrevet19,24. Efter 4 uger i kultur, havde HIOs udvidet tilstrækkeligt til at tillade mikroinjektion. HIOs blev microinjected med 4 kDa FITC-konjugeret dextran suspenderet i PBS eller PBS, som indeholder Clostridium difficile toksin kanaltilbehøret. C. difficile er en opportunistisk gastrointestinale patogen, der udstiller toksin-medieret epitelial toksicitet i HIOs25. Som positiv kontrol, blev EGTA tilføjet til HIO kultur medier i et undersæt af HIOs injiceret med PBS og FITC-dextran. EGTA er et calcium-chelator, der forårsager hurtig nedtrapning polymerisering af actin cytoskeleton42. FITC fluorescens blev overvåget i realtid på live imaging mikroskop i et kontrolleret miljø kammer og billeder blev taget til fange i 10-minutters intervaller.
Post-hoc analyse af billeddiagnostiske data afslørede betydelige forskelle i opbevaring af FITC fluorescens (figur 5). HIOs indsprøjtet med PBS beholdt næsten alle de fluorescerende signal stede ved t = 0, men HIOs, der var også injiceres med kanaltilbehøret af behandlet med EGTA udstillet et betydeligt fald i fluorescerende intensitet af 8 timer efter mikroinjektion (figur 5a). Imaging data blev kvantificeres for alle HIOs på alle tidspunkter til at generere en høj opløsning datasæt, der repræsenterer den relative ændring i fluorescerende intensitet over tid i hver eksperimentelle betingelse (figur 5B). Forskelle i epitelial permeabilitet blev evalueret ved beregningen af den gennemsnitlige afskaffelse (t1/2 ) FITC for hver behandling gruppe (tabel 1) og sammenligne forskelle i t t1/2 mellem grupper ved hjælp af Student's t-test. Kontrol-behandlede HIOs bevaret størstedelen af FITC fluorescerende signal for mere end 16 timer (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandling med EGTA reduceret betydeligt FITC-dextran eliminering tid i forhold til kontrol HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater25, mikroinjektion af kanaltilbehøret markant øget epitel barriere permeabilitet i forhold til kontrol behandling (t1/2 = 7.6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Således er både eksterne (EGTA) og microinjected (kanaltilbehøret) forbindelser i stand til at inducere betydelige ændringer i epitel barriere permeabilitet i HIOs. Disse resultater tyder på, at virkningerne af en bred vifte af farmakologiske stoffer, metabolitter, bakteriel produkter, cytokiner, vækstfaktorer og andre forbindelser på epitel barriere funktion kan evalueres ved hjælp af denne fremgangsmåde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandling</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Nedre 95% CI (h)</td>
			<td>Øvre 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrol</td>
			<td>17,11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanaltilbehøret</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: betyde afskaffelse tid (t1/2) til FITC-dextran i HIOs behandles med EGTA eller kanaltilbehøret. Enheder er timer efter mikroinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figur 1: grundlæggende layout af en microinjector og micromanipulator for HIO mikroinjektion. Dette billede viser et komplet supplement af udstyr, der anvendes til at udføre mikroinjektion af HIOs. Nøglekomponenter er mærket og oplysninger om bestilling kan findes i tabellen materialer. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figur 2: mikropipette puller. Kobber opvarmning spole hc, top klemme c1, bunden klemme (c2), puller arm (pa), varme udvalg toggle (ht) identificeres ved hjælp af pilene. Korrekt indstilling af varme 1 og PULL er angivet med rød tekst. Indsatsen viser en korrekt monteret glas glødetråd klar til opvarmning. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figur 3: repræsentant billeder af et væv-afledte HIO injiceres med FITC-dextran. (A) billede viser placeringen af glas microcapillary lige før indsættelse i HIO og mikroinjektion. (B) Brightfield billede af et væv-afledte menneskelige tarm organoids efter mikroinjektion af FITC-dextran. Bemærk at fluorescens signal er tilsyneladende selv uden brug af et bestemt filtersæt. Denne farvning aids mikroinjektion præcision. 3 X forstørrelse <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figur 4: Live billeddannelse workflow. (A) Screenshot illustrerer de nødvendige skridt til at indstille parametrene mikroskop, finde HIOs på diaset, og Gem position af scenen for hver HIO til afbildning. (B) Pre-tænkelig indstillinger til at indfange FITC kanalen med jævne mellemrum på hver af positionerne angivet i A. (C) efter imaging eksport af DV-format data filer som TIFF-billeder med et TIFF-billede pr. HIO pr. tidspunkt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figur 5: repræsentative resultater. (A) stamcelle-afledt menneskelige tarm organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) afbildet i 20 timer. HIOs var også microinjected med PBS (kontrol) eller Clostridium difficile toksin kanaltilbehøret (12,8 ng/µL) eller behandlet med 2 mM EGTA tilføjet til den eksterne medier. 4 X forstørrelse. (B) Plot af gennemsnitlig normaliseret FITC intensitet over tid i HIOs behandlet med PBS (kontrol), kanaltilbehøret eller EGTA. Fejllinjer udgør S.E.M. og n = 11 HIOs (kontrol), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (kanaltilbehøret). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Denne protokol beskriver måling af epitel barriere permeabilitet i real-time følgende farmakologiske behandling i menneskelige tarm organoids ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og live celle mikroskopi.

Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Måling og Real Time Visualisering af Somatisk Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknologi af primære mus intestinale Organoider ved hjælp af magnetisk nanopartikel Transduktionsvirale vektorer for frosne skæring

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Real-time bioluminescens billeddannelse af notch signalering dynamik under murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Sammenfatning af Suckling-til-fravænning overgang in vitro ved hjælp af føtale tarm Organoider

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro-kultur af Epiteliale celler fra forskellige anatomiske områder af den humane amniotiske membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generation af en menneskelig iPSC-baseret blod-hjerne barrierchip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...