Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Die Autoren möchten DRS. Stephanie Spohn und Basel Abuaita für viele nützliche Diskussionen über organoide Mikroinjektion danken. JRS wird vom Darm Stem Cell Consortium (U01DK103141), eine Kooperative Forschungsprojekt finanziert durch das National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK) und National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) unterstützt. JRS und VBY werden durch den Roman NIAID, Alternative Modellsysteme für enterischen Erkrankungen (NAMSED) Consortium (U19AI116482) unterstützt. DRH unterstützt die Mechanismen der mikrobiellen Pathogenese Training Zuschuss von National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (NIAID, T32AI007528) und der klinischen und translationalen Science Award an der Michigan-Institut für klinische und Gesundheit Forschung (UL1TR000433).
Die komplette Datendateien und Daten-Analyse-Code verwendet in dieser Handschrift sind an https://github.com/hilldr/HIO_microinjection erhältlich.

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte offen zu legen.

Dieses Protokoll stellt eine allgemeine Methode für die Mikroinjektion von Chios hPSC abgeleitet und Darm Organellen Gewebe abgeleitet und die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit. Wir haben auch unser Ansatz zur Analyse und Interpretation der Daten generiert, mit Hilfe dieser Methoden gezeigt. Angesichts der wachsenden Annahme Darm Organellen Modellsysteme16,20,21,28 und das langjährige Interesse an Darmbarriere Durchlässigkeit als physiologisch relevanten funktionellen Ergebnis3,4,5,6, erwarten wir, dass andere auf diesem Gebiet tätig werden können anwenden und auf diese Methoden aufbauen.
Es gibt mehrere Schritte, die für die Anwendung dieser Technik entscheidend sind. Zugang zu qualitativ hochwertigen hPSC- oder Gewebe abgeleiteten HIO Gewebe vor umfangreiche Experimente mit Mikroinjektion geschaffen werden sollte. HIO Makrostruktur möglicherweise heterogen, mit Variationen in Größe und Form, obwohl Gewebe Identität und zellulären Morphologie ist sehr reproduzierbar, bei der Verwendung von etablierten Methodik um Chios24zu generieren. Sphärische Chios, bestehend aus einer einzigen halbtransparenten Lumen und messen ca. 1 mm im Durchmesser sind ideal für Mikroinjektion und Messung der luminalen Fluoreszenz in Echtzeit. In einigen Fällen fehl, Mikroinjektion zu einem Zusammenbruch der HIO oder offensichtliche Undichtigkeit des injizierten Materials. Gescheiterten Chios können die Kultur gut Ermessen des Benutzers mithilfe einer standard Mikropipette entnommen werden. Auswahl von Chios für Mikroinjektion und Bildgebung der Objektive auf einer imaging Plattform berücksichtigen. Im Allgemeinen 2-4 X Objektive sind ideal für die Erfassung der kompletten HIO Fluoreszenzsignal, obwohl ein 10 X-Objektiv verwendet werden kann, wenn low-Power-Objektive nicht verfügbar sind oder die verfügbaren Chios sind &#60; 1 mm im Durchmesser. Imaging-Software darf für die automatisierte Erfassung von fluoreszierenden Bilder an definierten Stellen im Laufe der Zeit.
Mehrere Änderungen dieses Protokolls sind möglich, um die experimentellen Anforderungen anzupassen. Zum Beispiel die Ergebnisse der Barriere Funktionstests der Molekülgröße der Verbindungen im Einsatz43 abhängig gemacht werden und es kann zweckmäßig sein, Dextran-Vorbereitungen von unterschiedlichem Molekulargewicht zu testen. Darüber hinaus kann Hellfeld Bildgebung zusätzlich Fluoreszenz-Bildgebung als Indikator für die strukturelle Integrität der Gewebe25durchgeführt werden. Bei der Mikroinjektion von lebender Bakterien25,28,31,32,33,44ggf. Penicillin hinzufügen und Streptomycin oder Gentamicin HIO Kultur Medien vor oder nach Mikroinjektion. Außen an der Microcapillary wird bei der Befüllung mit der Bakterienkultur Aussetzung kontaminiert werden und dies kann den HIO Medien übertragen werden. Alternativ kann Mikroinjektion erfolgen auf Chios im extrazellulären Matrix (z. B. Matrigel) ohne Medien ausgesetzt die Medien hinzufügen, nachdem die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Dies kann Kontamination der extrazellulären Matrix und Außenseite der HIO einschränken. Bei der Planung von mikrobiellen Wachstums Assays es möglicherweise notwendig, Antibiotika in den Medien nach 1-2 h zu vermeiden, verlangsamt oder verhindert Wachstum von mikroinjiziert Organismen zu entfernen.
Schließlich ist in der Erkenntnis, dass nicht alle Forscher auf Mikroskopie Ausrüstung geeignet für in-vitro- Bildgebung zugreifen können, es wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Anweisungen in diesem Protokoll für die Fluoreszenz Datenerhebung auf Bilder angewendet werden können an festen Zeitpunkten mit standard Epifluorescent Mikroskopie ohne automatische Bildaufnahme oder Umweltkontrolle. Beispiele dafür finden Sie in den Berichten von Leslie und Huang Et al. 25, die C. Difficile Toxin Aktivität im Darm Organellen hPSC abgeleitet und Karve und Pradan Et Al. untersuchten 44, die epitheliale Barriere Permeabilität in ähnlichen hPSC abgeleitet Darm Organellen mikroinjiziert mit live E. Coliuntersucht. Manuelle Bedienung der bildgebenden Geräten führen größere Variation und Schwierigkeiten bei der Normalisierung der Fluoreszenzsignal. Bei der Durchführung manueller Bildgebung der FITC-Dextran Chios injiziert unbedingt feste Vergrößerung, fluoreszierende Anregung Intensität und Belichtungszeiten während das Experiment nicht zu verfälschen die Fluoreszenz Intensität Messungen zu gewährleisten.

Das Darmepithel bildet eine selektive Barriere, die den gerichteten Transport von Nährstoffen, H2O, Ionen und Abfallprodukte vermittelt bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Diffusion-vermittelten Austausch von andere Partikel zwischen Lumen und der mesenchymale Gewebe oder Blut Versorgung1,2. Die unspezifische Durchlässigkeit der intestinalen epithelialen Barriere galt lange Zeit einen wichtigen funktionelle Parameter in Gesundheit und Krankheit3,4,5,6, das spiegelt die Rate der Verbreitung von kleinen Molekülen über das Epithel über den parazellulär Platz. Messung der epitheliale Barriere Permeabilität kann durchgeführt werden, Tiermodelle7 und in menschlichen Patienten8 durch die Einnahme von Lactulose, hat keine spezifischen Transporter in den Magen-Darm-Trakt und die anschließende Sammlung und Messung von Lactulose Konzentrationen im peripheren Blut. Alternative eingenommen Marker der Barrierefunktion wie Eindringmittel beschrifteten Kohlenhydrate sind auch verfügbar9,10. Dieser Ansatz wurde angepasst für intestinale epitheliale Zellkulturen auf Transwell unterstützt11, einen vereinfachten Ansatz, ermöglicht eine bessere Kontrolle der experimentellen aber auch als schlechter Prädiktor für in Vivo kritisiert worden, angebaut Durchlässigkeit aufgrund des Fehlens von differenzierten epithelialen Subtypen und Gewebe Struktur12. Mit Kammern stellen einen weiteren Ansatz dar und ermöglichen die Messung der epitheliale Barriere-Funktion im ganzen Darmschleimhaut Ex Vivo13. Anwendung dieser Technik wird häufig durch Gewebe Verfügbarkeit und Zustand13,14begrenzt. Daher sind neue Methoden, die Reproduzierbarkeit und Durchsatz mit physiologische Relevanz Gleichgewicht notwendig.
Jüngste Entwicklungen in in-vitro- Organogenese führten zu die Annahme von 3D Gewebekultur Modellsysteme als eine anspruchsvolle Plattform für Rekapitulation der Dynamik von komplexen Gewebe15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Vor allem menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) abgeleitet menschlichen Darm Organellen (Chios)19,24 entstanden als reproduzierbar und experimentell gefügig Modellsystem für die Untersuchung von Host-mikrobielle Wechselwirkungen und epitheliale Barriere Dynamik25,26,27,28. In ähnlicher Weise menschliche Gewebe-abgeleitete Organellen (auch bekannt als Enteroids) können aus einem einfachen Biopsie-Verfahren abgeleitet werden und können als gefügig System verwendet werden, um die menschliche Physiologie und Krankheit15,29,30studieren. Mikroinjektion der menschliche Darm Organellen ermöglicht die Lieferung von experimentellen Verbindungen25 oder Mikroben25,31,32,33 , die apikale epithelialen live Oberfläche des organoide Lumen. Leslie und Huang Et al. 25 angepasst vor kurzem diese Technik zur Messung der Barriere Permeabilität in Chios mit Fluorescein erfolgt (FITC) Dextran nach Exposition gegenüber bakteriellen Toxinen beschriftet mikroinjiziert.
Dieses Protokoll dient als Leitfaden für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Chios hPSC abgeleitet und Gewebe abgeleitet Chios mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit geringfügigen Änderungen kann es auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion von Chios mit experimentellen Verbindungen dienen. Benutzer können dieses Protokoll mit zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion ergänzen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Fortschritte in der 3D Culture der intestinalen Gewebe durch Biopsie gewonnen oder aus pluripotenten Stammzellen über gezielte Differenzierung generiert haben dazu geführt, dass anspruchsvolle in-vitro- Modelle der Darmschleimhaut. Nutzt diese aufstrebenden Modellsysteme erfordert Anpassung der Werkzeuge und Techniken für 2D Kultur-Systeme und Tiere entwickelt. Hier beschreiben wir eine Technik zur Messung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen in Echtzeit. Dies geschieht durch Mikroinjektion von Eindringmittel beschriftet Dextran und Bildgebung auf einem inversen Mikroskop mit Epifluorescent Filter ausgestattet. Echtzeit-Messung der Durchlässigkeit Barriere im Darm Organellen erleichtert die Generation der hochauflösenden Zeitdaten im menschlichen Darm Epithelgewebe, obwohl diese Technik auch auf festen Timepoint imaging Ansätze angewendet werden kann. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar für die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität nach Exposition gegenüber pharmakologische Agenten, Bakterienprodukte oder Giftstoffe oder lebenden Mikroorganismen. Mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls dient auch als eine allgemeine Einführung in die Mikroinjektion der intestinalen Organellen und Benutzer können beschließen, dieses Protokoll durch zusätzliche oder alternative downstream-Anwendungen nach Mikroinjektion zu ergänzen.

Chios wurden aus menschlicher pluripotenter Stammzellen differenziert und kultiviert in Zelle Matrixlösung wie zuvor beschrieben19,24. Nach 4 Wochen in Kultur hatte die Chios ausreichend erweitert, um für die Mikroinjektion zu ermöglichen. Chios wurden mit 4 kDa konjugiert FITC Dextran in PBS oder PBS mit Clostridium Difficile Toxin TDCA suspendiert mikroinjiziert. C. Difficile ist ein opportunistischer Magen-Darm-Erreger, das Toxin-vermittelte epitheliale Toxizität in Chios25aufweist. Als Positivkontrolle wurde die HIO Kulturmedien in einer Teilmenge von Chios injiziert mit PBS und FITC-Dextran EGTA hinzugefügt. EGTA ist ein Kalzium-Chelator, die schnelle de-Polymerisation der Aktin-Zytoskelett-42verursacht. FITC Fluoreszenz wurde auf dem live imaging Mikroskop innerhalb einer kontrollierten Klimakammer in Echtzeit überwacht und Aufnahmen wurden in 10-Minuten-Takt.
Post-hoc-Analyse der Bilddaten ergab erhebliche Unterschiede in der Beibehaltung der FITC Fluoreszenz (Abbildung 5). Chios mit PBS injiziert erhalten fast alle das Fluoreszenzsignal bei t = 0, aber Chios, die auch mit TDCA von mit EGTA behandelt injiziert wurden eine erhebliche Abnahme der Fluoreszenz Intensität von 8 Stunden nach Mikroinjektion (Abbildung ausgestellt 5a). Imaging-Daten wurden für alle Chios zu allen Zeitpunkten eine hochauflösende Dataset repräsentiert die relative Änderung in Fluoreszenz Intensität im Laufe der Zeit in jeder Versuchsbedingung (Abb. 5 b) generieren quantifiziert. Unterschiede in der epithelialen Durchlässigkeit ausgewertet durch Berechnung der mittleren Beseitigung Zeit (t1/2 ) der FITC für jede Behandlungsgruppe (Tabelle 1) und vergleichen Unterschiede in t t1/2 mit der Student t-test. Kontrolle-behandelten Chios behielt die Mehrheit der FITC Fluoreszenzsignal für mehr als 16 Stunden (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandlung mit EGTA deutlich reduziert FITC-Dextran Beseitigung Zeit relativ zum Steuerelement Chios (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnisse25, Mikroinjektion TDCA deutlich erhöht epitheliale Barriere Permeabilität gegenüber Kontrollbehandlung (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). So sind externe (EGTA) und mikroinjiziert (TDCA) Verbindungen in der Lage, wesentliche Veränderungen in epitheliale Barriere Permeabilität in Chios induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Auswirkungen einer breiten Palette von pharmakologische Agenten, Metaboliten, Bakterienprodukte, Zytokine, Wachstumsfaktoren und anderen Verbindungen auf epitheliale Barriere-Funktion mit diesem Ansatz bewertet werden können.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandlung</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Untere 95 % CI (h)</td>
			<td>Obermaterial 95 % CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrolle</td>
			<td>17.11.</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45 Uhr</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDCA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: meine Beseitigung Zeit (t1/2) FITC-Dextran in Chios mit EGTA oder TDCA behandelt. Einheiten sind Stunden Post-Mikroinjektion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Grundlayout einer Microinjector und Mikromanipulator für HIO Mikroinjektion. Dieses Bild zeigt die komplette Ergänzung der Ausrüstung für die Durchführung der Mikroinjektion von Chios verwendet. Schlüsselkomponenten sind beschriftet und Bestellinformationen finden Sie in der Materialtabelle. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Mikropipette Puller. Das Kupfer Heizung Spule Hc, Spannfinger c1, untere Klemme (c2), Abzieher Arm (Pa), Hitze Auswahl ein/aus (ht) sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Die richtige Einstellung für HEAT 1 und ziehen sind in roter Schrift gekennzeichnet. Der Inset zeigt eine richtig montierte Glas-Filament für Heizung bereit. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Abbildung 3: repräsentative Bilder von einem Gewebe abgeleitet HIO injiziert mit FITC-Dextran. (A) Bild zeigt die Positionierung der Glas-Microcapillary kurz vor dem Einsetzen in die HIO und Mikroinjektion. (B) Hellfeld-Bild von einem Gewebe abgeleitet menschlichen Darm Organellen nach Mikroinjektion der FITC-Dextran. Beachten Sie, dass das Fluoreszenzsignal offensichtlich auch ohne die Verwendung eines bestimmten Filter-Sets ist. Diese Färbung hilft Mikroinjektion Präzision. 3 X Vergrößerung <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Live-imaging Workflow. (A) Screenshot zeigt die notwendigen Schritte zur Mikroskop parametrisieren, die Chios auf der Folie zu finden und speichern Sie die Position der Bühne für jede HIO, abgebildet werden. (B) Pre-Imaging-Einstellungen für die Erfassung des FITC-Kanals in regelmäßigen Abständen an die Positionen jeweils angegeben in A. (C) Post-Imaging-Export von Daten im DV-Format Dateien als TIFF-Bilder mit einem TIFF-Bild pro HIO pro Zeitpunkt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Abbildung 5: repräsentative Ergebnisse. (A) Stammzellen abgeleitet menschlichen Darm Organellen (HIO) mit 2 mg/mL FITC-Dextran mikroinjiziert (4 kDa) für 20 Stunden abgebildet. Chios wurden auch mit PBS (Kontrolle) oder Clostridium Difficile Toxin TDCA mikroinjiziert (12,8 ng/µL) oder mit 2 mM EGTA, um die externe Kultur Medien hinzugefügt behandelt. 4 X Vergrößerung. (B) Grundstück mittlere normalisierte FITC-Intensität im Laufe der Zeit in Chios behandelt mit PBS (Kontrolle), TDCA oder EGTA. Fehlerbalken darzustellen S.E.M und n = 11 Chios (Control), 3 Chios (EGTA), 6 Chios (TDCA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...