Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

המחברים רוצה להודות ד"ר סטפני Spohn, באזל Abuaita לדיונים שימושיים רבים על microinjection תא צורב. JRS נתמך על ידי ה מעיים תאי גזע Consortium (U01DK103141), פרויקט מחקר שיתופי שמומנו על ידי המכון הלאומי של הסוכרת העיכול, מחלות כליה (NIDDK), המכון הלאומי לאלרגיה ואת ומחלות זיהומיות (NIAID). JRS VBY נתמכים על ידי הרומן NIAID, מערכות מודל אלטרנטיבי קונסורציום המעית מחלות (NAMSED) (U19AI116482). DRH נתמכת מנגנוני פתוגנזה מיקרוביאלי הכשרה המענק של המכון הלאומי של אלרגיה ומחלה זיהומית (NIAID, T32AI007528) את פרס קלינית ומדעי Translational למכון מישיגן קלינית ובריאות מחקר (UL1TR000433).
קבצי נתונים וקוד ניתוח נתונים המשמשים כתב יד זה הינם זמינים https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה יוצר שיטה כללית של microinjection של HIOs hPSC, נגזר, רקמות, נגזר organoids מעיים, המדד של מחסום האפיתל חדירות בזמן אמת. הראו גם גישת ניתוח ופרשנות של נתונים שנוצר באמצעות שיטות אלה. בהתחשב אימוץ הגוברת של organoids מעיים דגם מערכות16,20,21,28 , האינטרס מכשול מעיים חדירות כרלוונטיים פיזיולוגית פונקציונלי ארוכת שנים תוצאה3,4,5,6, אנו צופים כי אחרים העובדים בתחום זה יוכלו להחיל ולבנות על שיטות אלה.
ישנם מספר שלבים אשר הם קריטיים ליישום של טכניקה זו. גישה hPSC באיכות גבוהה - או רקמות רקמות HIO נגזר גלובאלים לפני ניסויים נרחבים עם microinjection. HIO למפלגות עשויים להיות heterogenous, עם וריאציה הן בגודל וצורה, למרות רקמות זהות ועל מורפולוגיה הסלולר הוא מאוד לשחזור כאשר ניצול הוקמה מתודולוגיה ליצירת HIOs24. כדורי HIOs המורכב לומן שקופה למחצה יחיד ומדידת כ- 1 מ מ קוטר הינם אידיאליים עבור microinjection ומדידה של זריחה luminal בזמן אמת. במקרים מסוימים, microinjection ייכשל, וכתוצאה מכך התמוטטות HIO או ברור דליפה של חומר מוזרק. ניתן להסיר HIOs שנכשל מתרבות גם שיקול של המשתמש באמצעות micropipette סטנדרטי. שקול את העדשות המטרה זמין על פלטפורמת הדמיה בעת בחירת HIOs עבור microinjection ודימות. באופן כללי, 2-4 X המטרה עדשות הינם אידיאליים עבור לכידת את האות מלאה HIO פלורסנט, למרות מטרה X 10 עשוי לשמש אם עדשות צריכת חשמל נמוכה אינם זמינים או אם HIOs זמין &#60; 1 מ מ קוטר. תוכנות ליצירת תמונות לאפשר עבור לכידת תמונות פלורסנט בנקודות מוגדרות אוטומטית לאורך זמן.
מספר שינויים של פרוטוקול זה אפשריות על מנת להתאים את הדרישות ניסיוני. לדוגמה, התוצאות של בדיקות תפקוד המחסום עשוי להיות תלוי בגודל מולקולרי של תרכובות של שימוש43 , אפשר יהיה לבחון את ההכנות לתוספי של משקל מולקולרי בדרגות שונות. בנוסף, ניתן לבצע הדמיה brightfield בנוסף זריחה הדמיה כמחוון של שלמות המבנה הכולל של רקמות25. בעת ביצוע microinjection של חיידקים לחיות25,28,31,32,33,44, זה ייתכן שיהיה צורך להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין או גנטמיצין HIO תרבות לתקשורת לפני או לאחר microinjection. החלק החיצוני של microcapillary תזדהם במהלך מילוי עם המתלה התרבות חיידקי, זה עשוי להיות מועבר בתקשורת HIO. לחלופין, ניתן לבצע microinjection HIOs מושעה בתוך מטריצה חוץ-תאית (למשל, Matrigel) ללא מדיה, הוספת המדיה לאחר השלמת את microinjection. זה עלול להגביל את זיהום מטריצה חוץ-תאית, הפנים החיצוניים של HIO. בעת תכנון מבחני צמיחת חיידקים, ייתכן צורך להסיר אנטיביוטיקה בתקשורת לאחר 1-2 h כדי למנוע האטה או מניעת התפתחותם של אורגניזמים microinjected.
לבסוף, מתוך הכרה כי לא כל החוקרים תהיה גישה מיקרוסקופ ציוד מתאים במבחנה הדמיה, זה חשוב לציין כי ניתן להחיל את ההליכים המתוארים פרוטוקול זה לאיסוף נתוני קרינה פלואורסצנטית מתמונות שצולמו ב timepoints קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי רגיל ללא לכידת התמונה האוטומטי או פקדים איכות הסביבה. דוגמאות של גישה זו ניתן למצוא בדו ' ' חות מאת לסלי ווונג. et al. 25, שבדקו difficile ג פעילות הרעלן organoids מעיים נגזר hPSC,. Karve, Pradan et al. 44, שבדקו מחסום האפיתל חדירות ב דומה נגזר hPSC המעי organoids microinjected עם חיה e. coli. פעולה ידנית של ציוד הדימות עלול לגרום גדול וריאציה ולקשיי נרמול האות פלורסנט. כאשר ביצוע הדמיה ידנית של FITC-לתוספי מזריקים HIOs זה חיוני כדי לשמור על הגדלה קבועה, עירור פלורסנט בעוצמה ושעות חשיפה לאורך כל הניסוי כדי להימנע מעיוות המדידות פלורסנט בעוצמה.

האפיתל במעי יוצרת מחסום סלקטיבי המעביר התעבורה כיוונית של חומרים מזינים,2O H, יונים, ו הפסולת תוך מזעור ספציפי exchange בתיווך דיפוזיה של חלקיקים אחרים בין לומן ו mesenchymal רקמות או דם אספקה1,2. החדירות לא ספציפית של המכשול אפיתל המעי מזמן נחשב פרמטר פונקציונלי מפתח מחלה ובריאות3,4,5,6, המשקפת שיעור פעפוע של מולקולות קטנות על פני האפיתל דרך החלל paracellular. מדידה של חדירות מחסום האפיתל יכול להתבצע בחיה מודלים7 , בני אדם חולים8 באמצעות הבליעה של לקטולוז, אשר יש אין טרנספורטר ספציפי של מערכת העיכול, ואת האוסף עוקבות מדידת ריכוזים לקטולוז בדם ההיקפי. סמנים בלע חלופי של פונקציית מכשול כגון פחמימות fluorescently שכותרתו הינם גם זמינים9,10. גישה זו היה מותאם תרביות תאים אפיתל המעי גדל תומך Transwell11, בגישה פשוטה מאפשר בקרה ניסויית גדול יותר, אך גם ביקורת כמו מנבא המסכן של vivo חדירות בשל היעדר תת אפיתל הבדיל ו- מבנה רקמות12. באמצעות לשכות מייצג גישה אחרת ובכל זאת ולאפשר לשקילת מחסום האפיתל פונקציה mucosa מעיים כל לשעבר vivo13. היישום של טכניקה זו לעתים קרובות מוגבל על ידי רקמת זמינות ותנאי13,14. לכן שיטות חדשות אשר לאזן הפארמצבטית ותפוקת עם רלוונטיות הפיזיולוגיות נחוצים.
התפתחויות במבחנה organogenesis הובילו האימוץ של תרביות רקמה 3D דגם מערכות כפלטפורמה מתוחכמים recapitulating את הדינמיקה של רקמות מורכבות15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. בפרט, אנושי pluripotent תאי גזע (hPSC) נגזר organoids מעיים אנושיים (HIOs)19,24 הופיעו כמערכת מודל השפעול צייתן הדירים לצורך המחקר של אינטראקציות מיקרוביאליים המארח ו מחסום האפיתל dynamics25,26,27,28. באופן דומה, organoids נגזר רקמה אנושית (הידוע גם בשם enteroids) הנגזרות הליך הביופסיה פשוטה והוא יכול לשמש כמערכת צייתן ללמוד פיזיולוגיה אנושית ו מחלת15,29,30. Microinjection של organoids מעיים אנושיים מאפשרת למסירה של תרכובות ניסיוני25 או לחיות חיידקים25,31,32,33 הפסגה אפיתל פני השטח של לומן תא צורב. . לסלי ווונג et al. 25 הותאם לאחרונה בטכניקה זו כדי למדוד את מחסום חדירות ב- HIOs microinjected עם fluorescein isothiocyanate (FITC) עם התווית לתוספי בעקבות חשיפה ל: רעלנים חיידקי.
פרוטוקול זה מיועד כמדריך לשקילת מחסום האפיתל חדירות נגזר hPSC HIOs, HIOs, נגזר רקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם שינויים מזעריים, זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של HIOs עם תרכובות ניסיוני. משתמשים ייתכן שנשלים פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופית לאחר microinjection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

ההתקדמות בתרבות תלת-ממד של רקמות מעיים מושגת באמצעות ביופסיה או שנוצר מתאי גזע pluripotent באמצעות בידול מכוונת, גרמו מודלים מתוחכמים במבחנה של רירית המעי. מינוף מערכות אלה-דגם המתעוררים ידרוש עיבוד של כלים וטכניקות שפותחו עבור מערכות התרבות 2D של בעלי חיים. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת מחסום האפיתל חדירות ב organoids מעיים אנושיים בזמן אמת. זו מושגת על-ידי microinjection של fluorescently-ידי לתוספי, הדמיה-מיקרוסקופ הפוכה מצויד מסננים פלורסנטי. מדידת בזמן אמת החדירות מכשול ב organoids מעיים מקלה על הדור של נתונים זמני ברזולוציה גבוהה ברקמת האפיתל במעי האדם, למרות טכניקה זו ניתן גם ליישם קבוע timepoint הדמיה גישות. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות לשקילת חדירות מחסום האפיתל בעקבות חשיפה סוכנים תרופתי, מוצרים חיידקי או רעלנים או אורגניזמים חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם פריימר כללי על microinjection של organoids מעיים, משתמשים עשויים לבחור תוספת פרוטוקול זה עם יישומי הזרם נוספים או חלופיים בעקבות microinjection.

HIOs היו הבדיל מתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית בפתרון מטריקס תא כמו בעבר תיאר19,24. לאחר 4 שבועות בתרבות, HIOs היה להרחיב במידה מספקת כדי לאפשר microinjection. HIOs היו microinjected עם 4 kDa FITC מצומדת לתוספי מושעה PBS או PBS המכיל Clostridium difficile רעלן TcdA. ג difficile הוא פתוגן במערכת העיכול הזדמנותית זה מוצגים בתיווך הרעלן רעילות אפיתל HIOs25. כפקד חיובית, EGTA נוספה HIO תרבות המדיה של תת-קבוצה של HIOs מוזרק עם PBS ו FITC-לתוספי. EGTA הוא chelator סידן הגורמת מהירה והתבקשתי פלמור של שלד התא אקטין42. זריחה FITC היה פיקוח בזמן אמת על מיקרוסקופ הדמיה חיה בתוך תא הסביבה מבוקרת, תמונות נלקחו בשבי במרווחים של-10 דקות.
פוסט-הוק ניתוח של נתונים הדמיה גילה הבדלים ניכרים השמירה של זריחה FITC (איור 5). HIOs מוזרק עם PBS נשמר כמעט את כל האות פלורסנט נוכח t = 0, אולם HIOs זה גם הוזרקו TcdA של מטופלים עם EGTA הציג ירידה משמעותית בעוצמת פלורסנט לפי 8 שעות פוסט-microinjection (איור 5A)-נתוני הדמיה היו לכמת עבור כל HIOs בנקודות זמן כל לייצר dataset ברזולוציה גבוהה המייצג את השינוי היחסי בעוצמתם פלורסנט לאורך זמן במצב כל ניסיוני (איור 5B). הבדלים חדירות אפיתל הוערכו על ידי חישוב חיסול אכזרי הזמן (t1/2 ) של FITC עבור כל קבוצת הטיפול (טבלה 1) השוואת הבדלים t t1/2 בין קבוצות באמצעות הסטודנט t-מבחן. HIOs שטופלו שליטה נשמרים רוב FITC אות ניאון יותר מ 16 שעות (t1/2 = ± 17 0.3 h). טיפול עם EGTA הקטינה באופן משמעותי זמן ביעור FITC-לתוספי יחסי שליטה HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0.2 שעות; P = 1.3 x 10-8). בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר25, microinjection של TcdA גדל באופן משמעותי מחסום האפיתל חדירות יחסי שליטה טיפול (t1/2 = ± 7.6 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). לפיכך, חיצוני (EGTA) והן microinjected (TcdA) תרכובות המסוגלים גרימת שינויים משמעותיים במחסום האפיתל חדירות ב- HIOs. תוצאות אלו מראים כי ההשפעות של מגוון רחב של סוכנים תרופתי מטבוליטים, מוצרים חיידקי, ציטוקינים, גורמי גדילה, תרכובות אחרות על מחסום האפיתל פונקציה עשויים להעריך באמצעות גישה זו.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>טיפול</td>
			<td>Half-life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>להוריד את 95% CI (h)</td>
			<td>העליון 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שליטה</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>השקיעו 5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: זאת אומרת זמן ביעור (t1/2) עבור FITC-לתוספי ב HIOs שטופלו EGTA או TcdA. יחידות הינן microinjection שלאחר שעות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
איור 1: שהעיצוב הבסיסי של microinjector ו- micromanipulator עבור HIO microinjection. תמונה זו מציגה את המשלים מלאה של ציוד המשמש לביצוע microinjection של HIOs. רכיבי מפתח מסומנות, פרטי הזמנה ניתן למצוא בטבלת חומרים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
איור 2: פולר Micropipette. הנחושת חימום סליל hc, מהדק העליון c1, קלאמפ התחתון (c2), זרוע פולר (הרשות), חום הנבחר דו-מצבי (ht) מזוהים באמצעות החצים. ההגדרה הנכונה של חום 1 ולמשוך מסומנים בטקסט אדום. שיבוץ מראה של פילמנט זכוכית נטענים כהלכה מוכן לחימום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
איור 3: להחליפן בתמונות של רקמות-derived HIO הזריק FITC-לתוספי. תמונה (A) הממחיש את מיקום microcapillary זכוכית בדיוק לפני הכניסה לתוך HIO ו microinjection. (B) Brightfield דימוי רקמות-derived האנושי מעיים organoids לאחר microinjection של FITC-לתוספי. שימו לב כי האות זריחה נראית לעין אפילו ללא השימוש של ערכת מסנן ספציפי. הגיוון הזה מסייע דיוק microinjection. 3 X הגדלה <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
איור 4: חיים זרימת הדמיה- (א) מסך הממחישות את השלבים הנחוצים להפיכת קבע את הפרמטרים מיקרוסקופ, למצוא את HIOs על השקופית ולשמור את המיקום של הבמה עבור כל HIO לדימות. (B) הדמיה מראש הגדרות עבור לכידת בערוץ FITC במרווחי זמן קבועים בכל התנוחות שצוינו א (ג) הדמיה לאחר ייצוא של נתונים בפורמט DV קבצים כתמונות TIFF עם תמונה TIFF אחת לכל HIO לכל נקודת זמן.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
איור 5: תוצאות נציג. תאי גזע (A) נגזר organoids האנושי מעיים (HIO) microinjected עם 2 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי עם תמונה (4 kDa) במשך 20 שעות. HIOs היו microinjected גם עם PBS (בקרה) או Clostridium difficile הרעלן TcdA (12.8 ng/µL) או מטופלים עם 2 מ מ EGTA הוסיף למדיה תרבות חיצוניים. 4 X הגדלה. (B) מגרש בעוצמה אומר מנורמל FITC לאורך זמן, HIOs שטופלו PBS (בקרה), TcdA או EGTA. קווי שגיאה מייצגים S.E.M. ו- n = 11 HIOs (בקרה), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...