Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare d. ssa Stephanie Spohn e Abuaita di Basilea per molte discussioni utili su organoid microiniezione. Il JRS è supportato dal Consorzio intestinale delle cellule staminali (U01DK103141), un progetto di ricerca collaborativo finanziato dal National Institute of Diabetes e digestivo e malattie renali (NIDDK) e National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). Il JRS e VBY sono supportati dal romanzo NIAID, alternativa sistemi modello per Consorzio malattie enteriche (NAMSED) (U19AI116482). DRH è supportata la concessione di formazione meccanismi di patogenesi microbica dall'Istituto nazionale dell'allergia e malattie infettive (NIAID, T32AI007528) e il premio scienza traslazionale e clinici all'Istituto Michigan clinica e salute Ricerca (UL1TR000433).
I file di dati completi e il codice di analisi dei dati utilizzati in questo manoscritto sono disponibili presso https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

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	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse di rivelare.

Questo protocollo stabilisce un metodo generico per il microinjection di HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato organoids intestinale e la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale. Inoltre abbiamo dimostrato il nostro approccio all'analisi e interpretazione dei dati ottenuti con questi metodi. Dato il crescente adozione dei organoids intestinale sistemi modello16,20,21,28 e l'interesse di lunga data nella permeabilità della barriera intestinale come un fisiologicamente rilevanti funzionale risultato3,4,5,6, ci aspettiamo che gli altri che lavorano in questo campo sarà in grado di applicare e costruire su questi metodi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per l'applicazione di questa tecnica. Accesso a alta qualità hPSC - o tessuto derivata HIO tessuto dovrebbe essere stabilita prima sperimentazione estesa con microiniezione. HIO macrostruttura può essere eterogenea, con variazione di dimensioni e la forma, anche se identità del tessuto e la morfologia cellulare è altamente riproducibile quando si utilizza una metodologia consolidata per generare HIOs24. HIOs sferico costituito da un singolo lume semi-trasparente e misura circa 1 mm di diametro sono ideali per microiniezione e misura della fluorescenza luminal in tempo reale. In alcuni casi, microinjection avrà esito negativo, con conseguente crollo dell'HIO o evidenti perdite di materiale iniettato. HIOs fallito può essere rimosso dalla cultura bene a discrezione dell'utente utilizzando una micropipetta standard. Considerare le lenti dell'obiettivo su una piattaforma di imaging disponibili quando si seleziona HIOs microiniezione e imaging. In generale, 2-4 X lenti dell'obiettivo sono ideali per catturare il segnale fluorescente HIO completo, anche può essere usato un obiettivo 10x se lenti a bassa potenza non sono disponibili o se il HIOs disponibili sono &#60; 1 mm di diametro. Software di imaging dovrà consentire l'acquisizione automatizzata delle immagini fluorescenti in punti definiti nel corso del tempo.
Diverse modifiche del presente protocollo sono possibili al fine di soddisfare le esigenze sperimentali. Ad esempio, i risultati dei test di funzione di barriera possono essere dipendenti dal formato molecolare dei composti in uso43 e potrebbe essere appropriato testare preparazioni di destrano di peso molecolare variabile. Inoltre, campo chiaro imaging può essere eseguito oltre a formazione immagine di fluorescenza come un indicatore dell'integrità strutturale complessiva del tessuto25. Quando si esegue la microiniezione di batteri vivi25,28,31,32,33,44, può essere necessario aggiungere penicillina e streptomicina o gentamicina per terreni di coltura HIO prima o dopo microiniezione. L'esterno del microcapillary sarà contaminato durante il riempimento con la sospensione di coltura batterica e questo può essere trasferito ai media HIO. In alternativa, microinjection può essere eseguita su HIOs sospese nella matrice extracellulare (ad es., Matrigel) senza supporto, aggiungendo il supporto una volta completata la microiniezione. Questo potrebbe limitare la contaminazione per la matrice extracellulare e la faccia esterna della HIO. Quando si pianificano i saggi di crescita microbica, può essere necessario rimuovere gli antibiotici nei media dopo 1-2 h per evitare di rallentare o prevenire la crescita di organismi iniettati.
Infine, riconoscendo che non tutti i ricercatori avranno accesso alla microscopia attrezzature adatte a imaging in vitro , è importante sottolineare che le procedure descritte in questo protocollo per la raccolta dati di fluorescenza possono essere applicate alle immagini scattate timepoints fisso usando la microscopia epifluorescente standard senza cattura immagine automatizzati o di controlli ambientali. Esempi di questo approccio possono essere trovati nelle relazioni di Leslie e Huang et al. 25, che ha esaminato attività di tossina di c. difficile in hPSC-derivati organoids intestinale e Karve e Liliane et al. 44, che ha esaminato la permeabilità della barriera epiteliale in simili organoids intestinale hPSC-derivato microiniettati con live e. coli. Manuale di apparecchiature di imaging può comportare una maggiore variazione e difficoltà a normalizzare il segnale fluorescente. Quando eseguire imaging manuale del FITC-Destrano iniettato HIOs è essenziale mantenere ingrandimento fisso, l'intensità di fluorescenza eccitazione e tempi di esposizione in tutto l'esperimento per evitare di falsare le misure di intensità di fluorescenza.

L'epitelio intestinale forma una barriera selettiva che media il trasporto direzionale di nutrienti, H2O, ioni e prodotti di scarto, riducendo al minimo scambio di diffusione-mediata non specifico di altre particelle tra il lume e la mesenchimali del tessuto o sangue alimentazione1,2. La permeabilità non specifica della barriera epiteliale intestinale lungamente è stata considerata un parametro funzionale chiave sia in salute e in malattia3,4,5,6, che riflette il tasso di diffusione di piccole molecole attraverso l'epitelio tramite lo spazio paracellulare. Misura della permeabilità della barriera epiteliale possa essere condotti in modelli animali7 e in pazienti umani8 attraverso l'ingestione di lattulosio, che non ha nessun trasportatore specifico nel tratto gastrointestinale e la successiva raccolta e la misurazione delle concentrazioni di lattulosio nel sangue periferico. Marcatori ingeriti alternativi della funzione di barriera come carboidrati fluorescente contrassegnati sono anche disponibili9,10. Questo approccio è stato adattato per intestinale delle cellule epiteliali colture cresciute su Transwell supporta11, un approccio semplificato che consente un maggiore controllo sperimentale, ma inoltre è stato criticato come un preannunciatore povero di in vivo permeabilità a causa dell'assenza di sottotipi epiteliali differenziate e tessuto struttura12. Utilizzando camere rappresentano ancora un altro approccio e consentire la misurazione della funzione di barriera epiteliale nella mucosa intestinale complesso ex vivo13. Applicazione di questa tecnica è spesso limitata dal tessuto disponibilità e condizione13,14. Sono quindi necessari nuovi metodi che equilibrano la riproducibilità e la velocità effettiva con rilevanza fisiologica.
Recenti sviluppi nell'organogenesi in vitro hanno portato all'adozione di sistemi di coltura del tessuto 3D modello come una sofisticata piattaforma per ricapitolare le dinamiche di tessuti complessi15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. In particolare, pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) derivata organoids intestinale umano (HIOs)19,24 sono emersi come sistema modello riproducibile e sperimentalmente trattabili per lo studio delle interazioni ospite-microbiche e barriera epiteliale dinamica25,26,27,28. Analogamente, organoids tessuto-derivato umano (noto anche come enteroids) può essere derivato da una procedura di biopsia semplice e può essere utilizzato come un sistema trattabile per studiare la fisiologia umana e malattia15,29,30. Microiniezione di organoids intestinale umana permette per la consegna di composti sperimentali25 o live microbi25,31,32,33 per l'apicale epiteliale superficie del lume organoid. Leslie e Huang et al. 25 recentemente adattato questa tecnica per misurare la permeabilità della barriera in HIOs microiniettati con isotiocianato di fluorescina (FITC) etichettato destrano dopo esposizione a tossine batteriche.
Questo protocollo è inteso come una guida per la misura della permeabilità della barriera epiteliale in HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato HIOs utilizzando la microscopia a fluorescenza. Con modifiche minori, può anche servire come un iniettore generale il microinjection di HIOs con composti sperimentali. Gli utenti possono integrare questo protocollo con applicazioni aggiuntive o alternative a valle dopo microiniezione.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Progressi nella cultura 3D dei tessuti intestinali ottenuti mediante biopsia o generate da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretto, hanno portato nei modelli sofisticati in vitro della mucosa intestinale. Sfruttando questi sistemi modello emergenti richiedono adattamento di strumenti e tecniche sviluppate per gli animali e sistemi di coltura 2D. Qui, descriviamo una tecnica per misurare la permeabilità della barriera epiteliale in organoids intestinale umana in tempo reale. Ciò avviene mediante microiniezione di destrano fluorescente etichettati e imaging su un microscopio invertito con filtri epifluorescente. Misura in tempo reale della permeabilità della barriera in organoids intestinale facilita la generazione di dati ad alta risoluzione temporale in tessuto epiteliale intestinale umano, anche se questa tecnica può essere applicata anche al timepoint fisso approcci di imaging. Questo protocollo è facilmente adattabile per la misura della permeabilità di barriera epiteliale dopo l'esposizione ad agenti farmacologici, prodotti batterici o tossine o microrganismi vivi. Con modifiche minori, il presente protocollo può anche servire come un iniettore generale il microinjection dei organoids intestinale e gli utenti possono decidere di integrare questo protocollo con applicazioni a valle aggiuntive o alternative dopo microiniezione.

HIOs sono stati differenziati da cellule staminali pluripotenti umane e coltivate in soluzione a matrice cellulare come in precedenza descritto19,24. Dopo 4 settimane nella cultura, il HIOs aveva ampliato sufficientemente per consentire per il microinjection. HIOs erano microiniettati con 4 kDa coniugato FITC Destrano sospese in PBS o PBS contenente la tossina di Clostridium difficile TcdA. C. difficile è un agente patogeno opportunistico gastrointestinale che presenta tossicità epiteliale tossina-mediata in HIOs25. Come controllo positivo, EGTA è stato aggiunto al terreno di coltura HIO in un sottoinsieme di HIOs iniettato con PBS e FITC-Destrano. EGTA è un chelante del calcio che causa de-rapida polimerizzazione dell'actina citoscheletrica42. Fluorescenza FITC è stato monitorato in tempo reale su un microscopio di imaging dal vivo all'interno di una camera ambientale controllata e immagini sono state catturate in intervalli di 10 minuti.
Analisi post-hoc dei dati di imaging ha rivelato differenze sostanziali nella conservazione di fluorescenza FITC (Figura 5). HIOs iniettato con PBS conservato quasi tutto il segnale fluorescente presente a t = 0, tuttavia HIOs che inoltre sono stati iniettati con TcdA di trattati con EGTA ha esibito una sostanza diminuzione nell'intensità fluorescente dal post-microinjection 8 ore (Figura 5a). dati di formazione immagine sono stati quantificati per HIOs tutti tutti gli intervalli di tempo generare un dataset ad alta risoluzione che rappresenta la variazione relativa intensità fluorescente nel tempo in ogni condizione sperimentale (figura 5B). Differenze nella permeabilità epiteliale sono state valutate dal calcolo del tempo di media di eliminazione (t1/2 ) di FITC per ciascun gruppo di trattamento (tabella 1) e confrontare le differenze t t 1/2 tra gruppi utilizzo dello studente t-test. Controllo-trattati HIOs mantenuto la maggior parte del segnale fluorescente FITC per più di 16 ore (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Trattamento con EGTA riduce significativamente il tempo di eliminazione di FITC-Destrano relativo controllo HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Coerente con risultati precedentemente pubblicati25, microiniezione di TcdA significativamente aumentata permeabilità di barriera epiteliale rispetto al trattamento di controllo (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Così, sia esterni (EGTA) e iniettati (TcdA) composti sono in grado di indurre alterazioni significative nella permeabilità della barriera epiteliale in HIOs. Questi risultati indicano che gli effetti di una vasta gamma di agenti farmacologici, metaboliti, prodotti batterici, citochine, fattori di crescita e altri composti sulla funzione di barriera epiteliale possono essere valutati mediante questo approccio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trattamento</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Abbassare CI di 95% (h)</td>
			<td>Superiore 95% IC (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7,56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9,18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: significa tempo di eliminazione (t1/2) per FITC-Destrano in HIOs trattati con EGTA o TcdA. Le unità sono post-microiniezione ore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figura 1: layout di base di un microinjector e micromanipolatore per il microinjection HIO. Questa immagine mostra il complemento completo delle attrezzature utilizzate per l'esecuzione di microiniezione di HIOs. Componenti chiave sono etichettati e informazioni sugli ordini possono essere trovati nella tabella materiali. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figura 2: estrattore micropipetta. Il rame riscaldamento bobina hc, morsetto superiore c1, morsetto inferiore (c2), braccio estrattore (pa), attiva/disattiva selezione di calore (ht) sono identificati dalle frecce. L'impostazione corretta di calore 1 e PULL sono indicate in rosso. L'inserto mostra un filamento di vetro correttamente montato pronto per il riscaldamento. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figura 3: immagini rappresentative di un tessuto-derivato HIO iniettato con FITC-Destrano. (A) immagine dimostrando il posizionamento della microcapillary vetro appena prima dell'inserimento nel HIO e microiniezione. (B) immagine di campo chiaro di un tessuto-derivato organoids intestinale umano dopo microiniezione di FITC-Destrano. Si noti che il segnale di fluorescenza è apparente anche senza l'uso di un set di filtri specifici. Questa colorazione favorisce la precisione di microiniezione. Ingrandimento 3x <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figura 4: Live imaging del flusso di lavoro. (A) schermata che illustra i passaggi necessari per impostare i parametri del microscopio, trovare il HIOs sulla diapositiva e salvare la posizione del palco per ogni HIO essere imaged. Le impostazioni di pre-imaging (B) per catturare il canale FITC a intervalli regolari presso ciascuna delle posizioni specificate in A. (C) Post-imaging esportazione di dati in formato DV file come immagini TIFF con un'immagine TIFF per HIO per punto di tempo.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figura 5: risultati rappresentativi. (A) cellule staminali derivate organoids intestinale umano (HIO) microiniettati con 2 mg/mL FITC-Destrano (4 kDa) ripreso per 20 ore. HIOs erano anche microiniettati con PBS (controllo) o la tossina del Clostridium difficile TcdA (12,8 ng / µ l) o trattati con 2 mM EGTA aggiunto ai terreni di coltura esterno. Ingrandimento 4x. (B) trama di media intensità FITC normalizzato nel tempo in HIOs trattati con PBS (controllo), TcdA o EGTA. Barre di errore rappresentano s.e.m. e n = 11 HIOs (controllo), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Ricerca

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