Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
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著者は、organoid マイクロインジェクションの多くの有益な議論の夫妻ステファニー スポーンとバーゼルの Abuaita を感謝したいです。JRS は、腸管幹細胞コンソーシアム (U01DK103141)、国立研究所糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) と国立研究所のアレルギー ・感染症 (NIAID) によって資金を供給する共同研究プロジェクトによってサポートされます。JRS と VBY NIAID の小説、腸疾患 (NAMSED) コンソーシアム (U19AI116482) のための代替モデル システムによってサポートされます。DRH のサポート臨床および健康のためミシガン研究所国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID, T32AI007528) と臨床トランスレーショナル科学賞から微生物病因メカニズムの訓練グラント研究 (UL1TR000433)。
Https://github.com/hilldr/HIO_microinjection では、完全なデータ ファイルやこの原稿で使用されるデータ解析コードを楽しめます。

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このプロトコルは、リアルタイムで hPSC 派生 HIOs と組織由来腸オルガノイドのマイクロインジェクションと上皮関門の透過性の測定のための一般的な方法を確立します。これらのメソッドを使用して生成されたデータの分析と解釈へのアプローチもわかってきました。腸オルガノイドの成長の採用モデル システムを与えられた16,20,21,28と生理関連として腸管バリア透過性, 機能の長年の興味結果3,4,5,6、我々 はこの分野で働く人は適用し、これらのメソッドに基づいて構築することができることを見込んでいます。
この手法の適用に不可欠ないくつかの手順があります。高品質 hPSC - または派生 HIO 組織はマイクロインジェクションの広範な実験の前にすべき組織にアクセスできます。HIO マクロ組織は、組織アイデンティティおよび細胞形態が再現性の高い、この HIOs24を生成する確立された方法論を活用した異種サイズや形のバリエーションを持つ可能性があります。単一の半透明な内腔から成ると直径約 1 mm の球形 HIOs はマイクロインジェクションとリアルタイムで内腔の蛍光の測定に最適です。いくつかのケースで、HIO の崩壊や注入材の明らかな漏れのインジェクションは失敗します。失敗した HIOs は、標準的なマイクロ ピペットを使用してユーザーの裁量でよく文化から削除できます。マイクロインジェクションとイメージングの HIOs を選択するときは、イメージング プラットフォームで使用可能な対物レンズを検討してください。一般に、2-4 倍の対物レンズは完全な HIO 蛍光信号をキャプチャするために理想的な対物レンズ 10 倍は低消費電力のレンズが利用できない場合、または使用可能な HIOs が使用できますが &#60; に直径 1 mm。イメージング ソフトウェア定義されたポイントで蛍光画像の自動キャプチャ時間をかけて考慮しなければなりません。
このプロトコルのいくつかの変更は、実験の条件に適するために可能です。障壁関数テストの結果が使用43化合物の分子の大きさに依存して可能性がありますなど、さまざまな分子量デキストラン製剤をテストする適切なことがあります。また、組織25の全体的構造健全性の指標としての蛍光イメージングに加え明視野イメージングを実行可能性があります。生きたバクテリア25,28,31,32,33,44のマイクロインジェクションを実行すると、ペニシリンを追加する必要があり、ストレプトマイシンまたは前または後マイクロインジェクション HIO 文化メディアにゲンタマイシン。細菌培養懸濁液充填時、マイクロキャピ ラリーの外側が汚染になるし、これは HIO メディアに転送することがあります。また、マイクロインジェクションは HIOs 媒体なしで、細胞外基質 (例えば、マトリゲル) で中断、マイクロインジェクションが完了した後にメディアを追加することで実行できます。これは、細胞外マトリックスと、HIO の外部面への汚染を制限があります。微生物の増殖の試金を計画するときは、減速または microinjected の生物の成長を防止するを避けるために 1-2 時間後メディアで抗生物質を削除する必要があります。
最後に、撮影した画像をこのプロトコル蛍光データを収集するために記載されている手順を適用できることを指摘することが重要ですすべての研究者が体外イメージングに適した顕微鏡機器へアクセスできることを認識し、で自動化された画像のキャプチャや環境制御なし標準 epifluorescent 顕微鏡を用いた固定の縦長。このアプローチの例がレスリーと黄らレポート25、腸オルガノイドの hPSC から派生したと Karve と Pradanら c. ディフィシル毒素活性を調べた44、ライブ大腸菌と microinjected と同様 hPSC 由来腸 organoids 上皮関門の透過性を調べた。大きい変化と蛍光信号の正規化の難しさの画像装置の手動操作があります。HIOs を注入するデキストラン投与により手動イメージングを実行する固定倍率、蛍光励起強度および蛍光強度測定の歪みを防ぐため実験全体の露光時間を維持するために不可欠です。

腸上皮は内腔間の他の粒子の非特異的な拡散を介した exchange を最小限に抑えながら栄養素、H2O、イオン、および廃棄物の方向の輸送を仲介する選択的なバリアを形成し、間葉系組織または血液供給1,2。腸管の上皮バリアの非特異的な透磁率は長く健康と病気3,4,5,6の割合を反映する重要な機能パラメーターを考慮されました。傍細胞スペースを介して上皮小分子の拡散。上皮関門の透過性の測定を行なえる動物モデル7と消化管とその後のコレクションで特定のトランスポーターの無い、ラクツロースの摂取を介して人間の患者8ラクツロース末梢血中濃度の測定。蛍光に分類された炭水化物などバリア機能の代替摂取マーカー使用可能な9,10しています。このアプローチは、腸管上皮細胞文化 Transwell サポート11より実験的に制御できますが、 in vivoの貧しい予言者として批判されても単純化されたアプローチの栽培に適応されています。透水性上皮分化のサブタイプと組織構造12の不在のため。チャンバーを使用してもう一つのアプローチを表し、腸粘膜ex vivo13上皮バリア機能の測定を可能にします。この技法の応用頻繁、組織の可用性と条件13,14によって制限されます。従って生理学的な関連性と再現性とスループットのバランスを調整する新しい方法が必要です。
器官形成の in vitroにおける最近の動向は、複雑な組織15,16,17 のダイナミクスの概説のため高度なプラットフォームとして 3次元組織培養モデル システムの採用につながっています。 ,18,19,20,21,22,23。特に、ひと多能性幹細胞 (hPSC) に由来ひと腸 organoids (HIOs)19,24が宿主と細菌の相互作用の研究の再現性と実験的に解き得るモデル システムとして浮上していると上皮バリア ダイナミクス25,26,27,28。同様に、ヒト組織由来 organoids (として知られている enteroids) は単純な生検の手順から派生できるし、人間の生理と疾患15,29,30の勉強を扱いやすいシステムとして使用することができます。人間の腸オルガノイドのマイクロインジェクション実験化合物25を配信できますまたは微生物25,31,32,33頂端に上皮をライブorganoid 内腔の表面。レスリーと黄ら25最近 HIOs かに (FITC) デキストラン細菌毒素への暴露を次のラベルの microinjected の関門の透過性を測定するこの手法に適応。
このプロトコルは、hPSC 由来 HIOs と蛍光顕微鏡を用いた組織由来 HIOs 上皮関門の透過性の測定のためのガイドとして使用されます。マイナーな変更と実験的化合物と HIOs のマイクロインジェクションの一般的なプライマーとしても使えます。ユーザーは、マイクロインジェクション後追加または代替のダウン ストリーム アプリケーションでこのプロトコルを補う可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

腸粘膜の高度な体外モデル腸組織生検により得られたまたは、分化多能性幹細胞から生成される 3 D の文化の進歩をもたらしました。これらの新興国のモデル システムを活用ツールと 2次元培養系や動物のための技術の適応が必要になります。ここでは、リアルタイムで人間の腸 organoids 上皮関門の透過性を測定するための手法について述べる。これは、蛍光標識デキストランと epifluorescent フィルター装備倒立顕微鏡のイメージングのインジェクションで。腸オルガノイドの関門の透過性のリアルタイム計測を容易に人間の腸上皮組織の高分解能時系列データの生成この手法は固定 timepoint アプローチをイメージングにも適用できます。このプロトコルは生きている微生物や毒素、細菌の製品薬理学的薬剤への露出に続く上皮関門の透過性の測定のため容易に適応可能であります。マイナーな変更でこのプロトコルは腸オルガノイドのマイクロインジェクションの一般的な入門としても利用できます、ユーザー可能性があります次のマイクロインジェクション追加または代替のダウン ストリーム アプリケーションでこのプロトコルを補完するを選択します。

HIOs ひと多能性幹細胞から分化した培養細胞マトリックス ソリューションとして以前に説明した19,24.文化の 4 週間後、HIOs はマイクロインジェクションように十分に拡大していた。HIOs は、PBS またはクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA を含む PBS で中断 4 kDa FITC 結合デキストランと microinjected いた。C. ディフィシルは HIOs25で毒素を介する上皮毒性を示す日和見消化管病原体です。肯定的な制御としてグリコールエーテルジアミン四酢酸は、PBS と FITC デキストラン注入 HIOs のサブセットの HIO 文化メディアに追加されました。グリコールエーテルジアミン四酢酸はアクチン細胞骨格42の急速な解消重合を引き起こすカルシウムのキレート剤です。FITC の蛍光は制御環境チャンバ ライブ イメージング顕微鏡上でリアルタイムに監視され、10 分間隔で撮影します。
画像データの非定型分析では、FITC の蛍光 (図 5) の保持の相当な相違を明らかにしました。PBS の注入 HIOs 保持ほぼすべてtでの蛍光信号のグリコールエーテルジアミン四酢酸で処理の TcdA を注入したまた HIOs によって 8 時間後 (図蛍光強度の相当な減少を展示したしかし 0 を =5 a). イメージ投射データの各実験条件 (図 5 b) に時間をかけて蛍光強度の相対的な変化を表す高解像度データセットを生成するすべての時点ですべて HIOs の定量を行った。各治療群 (表 1) の FITC の平均除去時間 (t1/2 ) を計算してt t 1/2グループ間の違いを比較することによって評価した上皮の透過性の違い学生のtを使用して-をテストします。制御処理 HIOs 保持 16 時間以上の FITC の蛍光信号の大半 (t1/2 = 17 ± 0.3 h)。グリコールエーテルジアミン四酢酸による治療が相対 HIOs FITC デキストラン除去時間を大幅に削減 (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h;P = 10-8x 1.3)。以前に公開した結果25に一貫した、TcdA の大幅増加コントロール治療を基準にして上皮バリア透過性 (t1/2 = 7.6 ± 0.6 h;P = 10-4x 5.4)。したがって、外部 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) と microinjected (TcdA) の化合物は、HIOs 上皮関門の透過性の重要な変化を誘発することができます。このアプローチを使用して上皮バリア機能に及ぼす薬理学的薬剤、代謝物質、細菌の製品、サイトカイン、成長因子および他の化合物の広い範囲を評価することがありますが示唆されました。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>治療</td>
			<td>半減期 (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>下限 95年 %ci (h)</td>
			<td>上 95年 %ci (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コントロール</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>1,778万</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グリコールエーテルジアミン四酢酸</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 除去時間を意味する (t1/2) HIOs の FITC デキストラン グリコールエーテルジアミン四酢酸または TcdA で治療したため。単位は、時間後のインジェクションです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
図 1: マイクロインジェクターと HIO のインジェクション用マイクロマニピュレーターの基本的なレイアウトします。この画像は、HIOs のマイクロインジェクションを実行するために使用される機器の完全な補完を示します。主要なコンポーネントのラベルが付いています、材料表に注文情報を見つけることができます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
図 2: マイクロ ピペット引き手。加熱コイルhc、上側クランプc1、下部クランプ (c2)、銅の引き手の腕 (pa)、熱の選択の切り替え (ht) は、矢印によって識別されます。熱 1 とプルの正しい設定は赤のテキストで表示されます。はめ込みは、暖房の準備が正しくマウントされているガラス フィラメントを示しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
図 3: FITC デキストラン注入組織由来の HIO の代表的なイメージです。(A) イメージは HIO とマイクロインジェクション挿入直前ガラス マイクロキャピ ラリーの位置を示します。(B) FITC デキストランの顕微注入後の組織由来、人間の腸オルガノイドの明視野イメージ。蛍光信号が特定のフィルターのセットの使用がなくても明らかであることに注意してください。この配色機能は、マイクロインジェクション精度を支援します。3 倍の倍率<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
図 4: 画像処理ワークフローのライブします。(A) スクリーン ショット顕微鏡パラメーターを設定、スライド上の HIOs を見つけるし、イメージを作成する各の HIO のための段階の位置を保存するための手順を示します。それぞれの位置で定期的に FITC チャンネルをキャプチャするため (B) 事前イメージング設定が、DV フォーマット データの A. (C) イメージ作成後輸出時点あたり HIO 1 つの TIFF イメージを持つ TIFF イメージとしてのファイルを指定します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
図 5: 代表結果。(A) 幹細胞由来 2 mg/ml の FITC デキストラン microinjected 人間の腸 organoids (HIO) 20 時間 (4 kDa) のイメージを作成します。HIOs いた PBS (コントロール) とクロストリジウム ・ ディフィシル毒素 TcdA microinjected も (12.8 ng/μ L) か、外部の文化メディアに追加されますグリコールエーテルジアミン四酢酸 2 mM。4 倍の倍率。HIOs で時間の経過と共に平均正規化 FITC 強度 (B) プロットは PBS (コントロール)、TcdA、またはグリコールエーテルジアミン四酢酸で処理。誤差範囲を表す S.E.M. とn = 11 HIOs (コントロール)、3 HIOs (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、6 HIOs (TcdA)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

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Research

JoVE Journal

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

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