Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Forfatterne vil takke Dr. Stephanie Spohn og Basel Abuaita for mange nyttig diskusjoner om organoid microinjection. JRS støttes av Intestinal stamcelleforskningen Consortium (U01DK103141), en felles forskningsprosjekt finansiert av National Institute for Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (NIDDK) og National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID). JRS og VBY støttes av NIAID romanen, alternativ modellsystemer for Enteric sykdommer (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH støttes mekanismer av mikrobielle patogenesen trening stipend fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID, T32AI007528) og kliniske og translasjonsforskning Science award til Michigan Institute for klinisk og helse Forskning (UL1TR000433).
Komplett datafilene og data analyse som brukes i dette manuskriptet er tilgjengelig på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter avsløre.

Denne protokollen etablerer en generell metode for microinjection av hPSC-avledet HIOs og vev-avledet intestinal organoids og måling av epitelial barriere permeabilitet i sanntid. Vi har også vist vår tilnærming til analyse og tolkning av dataene som genereres ved hjelp av disse metodene. Gitt den økende bruk av intestinal organoids modellsystemer16,20,21,28 og langvarig interesse i intestinal barriere permeabilitet som en fysiologisk relevante funksjonelle utfallet3,4,5,6, forventer vi at andre arbeider på dette feltet vil kunne bruke og bygge på disse metodene.
Det er flere trinn som er avgjørende for anvendelsen av denne teknikken. Tilgang til høykvalitets hPSC- eller vev avledede HIO vev bør opprettes før omfattende eksperimentering med microinjection. HIO macrostructure kan være heterogene, med variasjon i både størrelse og form, men vev identitet og mobilnettet morfologi er svært reproduserbar når utnytte etablerte metodikk for å generere HIOs24. Sfærisk HIOs består av en enkelt semi-transparent lumen og måler ca 1 mm i diameter er ideelle for microinjection og måling av luminal fluorescens i sanntid. I noen tilfeller mislykkes microinjection, som resulterer i sammenbruddet av HIO eller åpenbare lekkasje injisert materiale. Mislykkede HIOs kan fjernes fra kulturen i brukerens skjønn bruker standard brønnene. Vurder målet linsene tilgjengelig på en tenkelig plattform når HIOs for microinjection og bildebehandling. Generelt, 2-4 X målet linser er ideelt for å fange fullstendig HIO fluorescerende signalet, selv om en 10 X-målet kan brukes hvis strømsparingsmodus linser ikke er tilgjengelig eller hvis de tilgjengelig HIOs &#60; 1 mm i diameter. Bildebehandlingsprogrammer må tillate automatiserte Chu fluorescerende bilder på definerte poeng over tid.
Flere endringer i denne protokollen er mulig for å dekke kravene eksperimentelle. For eksempel resultatene av barriere funksjon tester kan være avhengig av molekylære størrelsen av forbindelser i bruk43 og det kan være hensiktsmessig å teste dekstran forberedelser av varierende molekylvekt. I tillegg kan brightfield imaging utføres i tillegg til fluorescens imaging som en indikator på den generelle strukturelle integriteten av vev25. Når du utfører microinjection av levende bakterier25,28,31,32,33,44, det kan være nødvendig å legge penicillin og Streptomycin eller gentamicin til HIO kultur media før eller etter microinjection. Utsiden av microcapillary vil bli forurenset under fylling med bakteriell kultur suspensjon og dette kan overføres til HIO media. Alternativt kan microinjection utføres på HIOs suspendert i ekstracellulær matrix (f.eks Matrigel) uten media, legge til media etter at microinjection er fullført. Dette kan begrense forurensning ekstracellulær matrix og eksterne ansiktet til HIO. Når du planlegger mikrobiell vekst analyser, kan det være nødvendig å fjerne antibiotika i media etter 1-2 h å unngå bremse eller hindrer vekst av microinjected organismer.
Endelig er erkjenner at ikke alle forskere vil ha tilgang til mikroskopi utstyr egnet i vitro bildebehandling, det viktig å påpeke at prosedyrene som står på denne protokollen for innsamling av fluorescens data kan brukes på bilder tatt på fast timepoints med standard epifluorescent mikroskopi uten automatiserte image fange eller miljøkontroller. Eksempler på dette finnes i rapportene av Leslie og Huang et al. 25, som undersøkte C. difficile gift aktivitet i hPSC-avledet intestinal organoids og Karve og Pradan et al. 44, som undersøkte epithelial barriere permeabilitet i lignende hPSC-avledet intestinal organoids microinjected med live E. coli. Manuelle betjening av tenkelig utstyr kan medføre større variasjon og vanskeligheter med å normalisere fluorescerende signalet. Når utføre manuell avbildning av FITC-dekstran injisert HIOs er det viktig å opprettholde fast forstørrelse, fluorescerende eksitasjon intensitet og eksponeringstider gjennom å unngå å fordreie fluorescerende intensitet målinger.

Intestinal epitel danner en selektiv barriere som formidler retningsbestemt transport av næringsstoffer, H2O, ioner og avfallsprodukter samtidig minimere uspesifikke diffusion-mediert utveksling av andre partikler mellom lumen og mesenchymal vev eller blod forsyning1,2. Uspesifikke permeabilitet av intestinal epithelial barrieren har lenge vært ansett som en funksjonell Nøkkelparameteren i både helse og sykdom3,4,5,6, som reflekterer satsen av spredning av små molekyler over epitel via paracellular plassen. Måling av epitelial barriere permeabilitet kan gjennomføres på dyr modeller7 og i menneskelige pasienter8 gjennom inntak av Laktulose, som har bestemte transporter i fordøyelsessystemet, og den påfølgende samlingen og måling av Laktulose konsentrasjonene i perifert blod. Alternative inntatt markører for barriere funksjon som fluorescently merket karbohydrater er også tilgjengelige9,10. Denne tilnærmingen har blitt tilpasset for intestinal epithelial cellekulturer dyrket på Transwell støtter11, en forenklet tilnærming som tillater større eksperimentelle kontroll, men har også blitt kritisert som en dårlig prediktor for i vivo permeabilitet av differensiert epithelial subtyper og vevet struktur12. Bruke kamre representerer enda en tilnærming og tillate måling av epitelial barriere funksjon i hele tarmen ex vivo13. Bruk av denne teknikken er ofte begrenset av vev tilgjengelighet og tilstand13,14. Dermed er nye metoder som balanserer reproduserbarhet og gjennomstrømning med fysiologiske relevans nødvendig.
Siste utviklingen i i vitro organogenesen har ført til innføringen av 3D vev kultur modellsystemer som en sofistikert plattform for recapitulating dynamikken i komplekse vev15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. Spesielt menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) avledet menneskelige intestinal organoids (HIOs)19,24 har dukket opp som en reproduserbare og eksperimentelt medgjørlig modellsystem for studiet av vert-mikrobiell interaksjoner og epitel barriere dynamics25,26,27,28. Tilsvarende menneskelig vev-avledet organoids (også kjent som enteroids) kan utledes fra en enkel biopsiprosedyre og kan brukes som et tett system menneskelige fysiologi og sykdom15,29,30. Microinjection av menneskelig intestinal organoids tillater for levering av eksperimentelle forbindelser25 eller live mikrober25,31,32,33 til apikale epithelial overflaten av organoid-lumen. Leslie og Huang et al. 25 tilpasset nylig denne teknikken for å måle barriere permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein isothiocyanate (FITC) kalt dekstran etter eksponering for bakteriell giftstoffer.
Denne protokollen er ment som en guide for måling av epitelial barriere permeabilitet i hPSC-avledet HIOs og vev-avledet HIOs med fluorescerende mikroskopi. Med mindre endringer, kan den også fungere som en generell primer på microinjection av HIOs med eksperimentelle forbindelser. Brukere kan supplere denne protokollen med ytterligere eller alternative nedstrøms programmer etter microinjection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Fremskritt i 3D kultur av intestinal vev innhentet gjennom biopsi eller generert fra pluripotent stamceller via rettet differensiering, har resultert i sofistikert i vitro modeller av tarmen. Utnytte disse nye modellsystemer krever tilpasning av verktøy og teknikker utviklet for 2D kultur og dyr. Her beskriver vi en metode for å måle epithelial barriere permeabilitet i menneskelig intestinal organoids i sanntid. Dette oppnås ved microinjection av fluorescently-merket dekstran og bildebehandling på en invertert mikroskopet med epifluorescent filtre. Sanntids måling av barriere permeabilitet i intestinal organoids muliggjør generasjonen av høy oppløsning timelige data i menneskelig intestinal epitel vev, selv om denne teknikken kan også benyttes til fast timepoint imaging tilnærminger. Denne protokollen er lett tilpasses for måling av epitelial barriere permeabilitet etter eksponering for farmakologisk agenter, bakteriell produkter eller giftstoffer eller levende mikroorganismer. Denne protokollen kan også tjene som en generell primer på microinjection av intestinal organoids med mindre endringer, og brukere kan velge å supplere denne protokollen med ytterligere eller alternative nedstrøms programmer etter microinjection.

HIOs var differensiert fra menneskelige pluripotent stamceller og kultivert i cellen matrix løsning som tidligere beskrevet19,24. Etter 4 uker i kultur, hadde HIOs utvidet tilstrekkelig for å tillate microinjection. HIOs var microinjected med 4 kDa FITC-konjugerte dekstran suspendert i PBS eller PBS med Clostridium difficile gift TcdA. C. difficile er en opportunistisk gastrointestinal patogen som viser gift-mediert epithelial toksisitet i HIOs25. Som en positiv, ble EGTA lagt til HIO kultur media i et delsett av HIOs injisert med PBS og FITC-dekstran. EGTA er en kalsium chelator som fører til rask de polymerisering av utgangen cytoskjelett42. FITC fluorescens var overvåking i sanntid på live bildebehandling mikroskop i et kontrollert miljø kammer og bilder ble tatt i 10 minutters intervaller.
Post-hoc analyse av tenkelig data avslørte betydelige forskjeller i oppbevaring av FITC fluorescens (figur 5). HIOs injisert med PBS beholdt nesten alle fluorescerende signalet tilstede ved t = 0, men HIOs som også ble injisert med TcdA av behandlet med EGTA utstilt en betydelig reduksjon i fluorescerende intensiteten av 8 timer etter microinjection (figur 5a). bildebehandling data kvantifisert for alle HIOs på alle tidspunkt å generere høy oppløsning dataset som representerer den relative endringen i fluorescerende intensitet over tid i hver eksperimentelle tilstand (figur 5B). Forskjeller i epithelial permeabilitet ble vurdert ved beregning av gjennomsnittlig eliminering-tid (t1/2 ) av FITC for hver behandling (tabell 1) og sammenligne forskjeller i t t1/2 mellom grupper ved hjelp av Student t-test. Kontroll-behandlet HIOs beholdt fleste FITC fluorescerende signalet for mer enn 16 timer (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandling med EGTA betydelig redusert FITC-dekstran eliminering tid i forhold til kontrollen HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). I samsvar med tidligere publiserte resultatene25, microinjection av TcdA betydelig økt epithelial barriere permeabilitet i forhold til kontrollen behandling (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Dermed er både eksterne (EGTA) og microinjected (TcdA)-forbindelser i stand til å indusere betydelige endringer i epithelial barriere permeabilitet i HIOs. Disse resultatene tyder på at effekten av en rekke pharmacologic agenter, metabolitter, bakteriell produkter, cytokiner, vekstfaktorer og andre forbindelser på epithelial barriere funksjonen kan evalueres ved hjelp av denne tilnærmingen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandling</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Lavere 95% CI (h)</td>
			<td>Øvre 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontroll</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: betyr eliminering tid (t1/2) for FITC-dekstran i HIOs behandlet med EGTA eller TcdA. Enhetene er timer etter microinjection.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figur 1: utforming av microinjector og micromanipulator for HIO microinjection. Dette bildet viser den komplette komplettere av utstyr som brukes til å utføre microinjection av HIOs. Nøkkelkomponenter merket og bestillingsinformasjon finnes i tabellen materialer. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figur 2: brønnene avtrekker. Kobber oppvarming coil hc, topp klemme c1bunnen klemme (c2), avtrekker arm (pa), varme utvalg veksle (ht) identifiseres av pilene. Riktig innstilling for 1 HEAT og trekk vises i rød tekst. Rammemargen viser en riktig montert glass filament klar for oppvarming. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figur 3: representant bilder av en vev-avledet HIO injisert med FITC-dekstran. (A) bildet viser plasseringen av glass microcapillary like før innsetting i HIO og microinjection. (B) Brightfield bildet av en vev-avledet menneskelige intestinal organoids etter microinjection av FITC-dekstran. Merk at fluorescens signalet er tilsynelatende selv uten bruk av et spesifikt filter-sett. Denne farge hjelpemidler microinjection presisjon. 3 X forstørrelse <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figur 4: Live bildebehandling. (A) skjermbilde illustrerer nødvendig for å angi parametere for mikroskop, finne HIOs på lysbildet og lagre posisjonen til scenen for hver HIO til å avbildes. (B) før imaging innstillinger for å fange FITC kanalen med jevne mellomrom på hver av posisjonene angitt i A. (C) etter imaging eksport av DV formatere data filer som TIFF-bilder med et TIFF-bilde per HIO per punkt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figur 5: representant resultater. (A) Stamcelle-avledet menneskelige intestinal organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dekstran (4 kDa) avbildet i 20 timer. HIOs var også microinjected med PBS (kontroll) eller Clostridium difficile giften TcdA (12,8 ng/µL) eller behandlet med 2 mM EGTA lagt til eksterne kultur media. 4 X forstørrelse. (B) tomt betyr normaliserte FITC intensitet over tid i HIOs behandlet med PBS (kontroll), TcdA eller EGTA. Feilfelt representerer S.E.M. og n = 11 HIOs (kontroll), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Denne protokollen beskriver måling av epitelial barriere permeabilitet i sanntid følgende farmakologisk behandling i menneskelig intestinal organoids med fluorescerende mikroskopi og levende celle mikroskopi.

Sanntids måling av epitelial barriere permeabilitet i menneskelig Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Real Time Kinetic Måling og visualisering av somatiske Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generering av IPSC-avledet menneskelige hjerne Organoids til Model Tidlig nevrologiske lidelser

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av flercellede Human Primary livmor Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Real-Time bioluminesens Imaging av hakk signalering dynamikk under murine neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating patte-til-avvenning overgang in vitro bruker fosterets intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro kultur av epitelceller fra ulike anatomiske regioner av Human fostervann membran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generasjon av en human iPSC-basert blod-brain barriere chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...