Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Drs. Stephanie Спон и Базель Abuaita для многих полезных обсуждений по органоид микроинъекции. JRS поддерживается консорциумом кишечных стволовых клеток (U01DK103141), совместный исследовательский проект, финансируемый национального института диабета и пищеварительной и заболеваний почек (NIDDK) и национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID). JRS и VBY поддерживаются NIAID роман, альтернативные модели систем для кишечных заболеваний (NAMSED) консорциума (U19AI116482). DRH поддерживается механизмов микробного патогенез обучения грант от национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID, T32AI007528) и клинические и поступательного науки награду Мичиган института клинической и здравоохранения Исследований (UL1TR000433).
Полные данные файлы и код анализа данных, используемые в этой рукописи доступны на https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Авторы могут не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов раскрыть.

Этот Протокол устанавливает общего назначения метод для измерения проницаемость эпителия барьер и микроинъекции hPSC производные HIOs и ткани производные кишечных organoids в режиме реального времени. Мы также продемонстрировали наш подход к анализу и интерпретации данных, получаемых с помощью этих методов. Учитывая растущее принятие кишечных organoids модель систем16,20,,2128 и давний интерес к проницаемость кишечного барьера как физиологически соответствующих функциональных Результат3,4,5,6, мы ожидаем, что другие работающие в этой области будет иметь возможность применять и развивать эти методы.
Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для применения этого метода. Доступ к высоким качеством hPSC - или производных HIO ткани должны создаваться до широких экспериментов с микроинъекции ткани. HIO макроструктура может быть гетерогенных, изменения в размер и форму, хотя личность ткани и клеточной морфологии высоко воспроизводимый при использовании установленной методологии для создания HIOs24. Сферические HIOs, состоящий из одного полупрозрачные люмен и измерения диаметром около 1 мм идеально подходят для микроинъекции и измерения Люминал флуоресценции в режиме реального времени. В некоторых случаях будет не микроинъекции, в результате распада HIO или очевидные утечки введенного материала. Не удалось HIOs могут быть удалены из культуры также по усмотрению пользователя с помощью стандартной микропипеткой. Рассмотрим доступны на платформе тепловизионных объективов при выборе HIOs микроинъекции и изображений. В общем, 2-4 X объективов идеальны для захвата полного HIO флуоресцентные сигнал, хотя 10 X цели может быть использован, если линзы малой мощности не доступны или если имеющиеся HIOs &#60; 1 мм в диаметре. Изображений программное обеспечение необходимо разрешить для автоматического захвата флуоресцентных изображений в определенных точках с течением времени.
Для того, чтобы потребностям экспериментальные возможны несколько модификации настоящего Протокола. Например результаты испытаний барьер функция может быть зависимым от молекулярного размера соединений в использование43 , и это может быть уместно для тестирования препаратов декстран разной молекулярной массы. Кроме того помимо флуоресценции изображений в качестве показателя общей структурной целостности тканей25может выполняться brightfield изображений. При выполнении микроинъекции живых бактерий25,28,,3132,,3344, это может быть необходимо добавить пенициллин и Стрептомицина или гентамицин HIO культуры средств массовой информации до или после микроинъекции. Вне микрокапиллярной будет быть загрязнены во время наполнения с подвеской бактериальной культуры, и это может быть передана СМИ HIO. Поочередно микроинъекции может выполняться на HIOs приостановлено в внеклеточного матрикса (например, Matrigel) без СМИ, добавляя средства массовой информации, после завершения микроинъекции. Это может ограничить загрязнение внеклеточного матрикса и внешний облик HIO. При планировании микробного роста анализов, это может быть необходимо удалить антибиотиков в СМИ после 1-2 h, чтобы избежать замедления или предотвращения роста microinjected организмов.
Наконец признавая, что не все исследователи будут иметь доступ к оборудованию микроскопии, подходит для изображений в vitro , важно отметить, что процедуры, изложенные в настоящем Протоколе, для сбора данных флуоресценции могут применяться для получения изображений в фиксированной timepoints с помощью стандартных epifluorescent микроскопии без автоматизированного образов или экологического контроля. Примеры этого подхода можно найти в докладах, Лесли и Хуан и др. 25, обследовавший C. difficile токсин деятельности в hPSC производные кишечных organoids и Karve и Pradan et al. 44, обследовавший проницаемость эпителия барьер в подобных hPSC производные кишечных organoids microinjected с живой E. coli. Руководство по эксплуатации рентгенографическое оборудование может привести к большей вариации и трудности в деле нормализации флуоресцентного сигнала. При выполнении ручной изображений FITC-декстрана вводят HIOs важно поддерживать фиксированный масштаб, флуоресцентный возбуждения интенсивности и длительности выдержки на протяжении эксперимента, чтобы избежать искажения измерений интенсивности флуоресценции.

Кишечного эпителия образует избирательный барьер, опосредует направленного транспорта питательных веществ, H2O, ионов, и отходов при сведении к минимуму неспецифических диффузии опосредованной обмен других частиц между просвета и Мезенхимальные ткани или крови поставки1,2. Неспецифические проницаемость кишечного эпителия барьер уже давно считается ключевых функциональных параметров в здоровье и болезни3,4,5,6, которая отражает скорость Диффузия малых молекул через эпителий через параклеточный пространства. Измерения проницаемости эпителиальных барьер может проводиться в животных модели7 и8 человека пациентов через проглатывание лактулоза, который имеет без конкретных транспортер в желудочно-кишечном тракте и последующего сбора и измерение концентраций лактулоза в периферической крови. Альтернативные попадает маркеры барьерной функции такие как дневно обозначенные углеводы являются также доступны9,10. Этот подход был адаптирован для эпителиальных клеток кишечника культур, выращенных на Transwell поддерживает11, упрощенный подход, который позволяет для большего контроля экспериментальный, но также подверглась критике как бедных предсказатель в vivo проницаемость отсутствием дифференцированных эпителиальных подтипы и ткани структура12. С помощью камеры представляют собой еще один подход и позволяют для измерения эпителиальных барьерной функции в целом интестинальную ex vivo13. Применение этого метода часто ограничивается ткани наличия и состояния13,14. Таким образом, необходимы новые методы, которые баланс воспроизводимость и пропускную способность с физиологическое значение.
Недавние события в в vitro органогенеза привели к принятию систем модели 3D культуры ткани как сложные платформы для изложив динамика сложных тканей15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. В частности, человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) производные человека кишечные organoids (HIOs)19,24 появились как воспроизводимость и экспериментально шансов справиться с возникающими модель системы для изучения хост микробных взаимодействий и Эпителиальный барьер динамика25,26,27,28. Аналогичным образом человеческие ткани производные organoids (также известный как enteroids) могут быть получены от простой биопсия процедура и может использоваться как шансов справиться с возникающими системы для изучения физиологии человека и болезнь15,29,30. Микроинъекции человека кишечные organoids позволяет для доставки экспериментальных соединений25 или жить микробы25,31,32,33 к апикальной эпителия поверхность органоид люмен. Лесли и Хуан и др. 25 недавно адаптировать эту технику для измерения проницаемости барьер в HIOs, microinjected с флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) помечены декстрана, после воздействия бактериальных токсинов.
Этот протокол предназначен в качестве руководства для измерения проницаемость эпителия барьер в hPSC производные HIOs и HIOs тканей, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. С незначительными изменениями он также может служить общей грунт на микроинъекции HIOs с экспериментальной соединений. Пользователи могут дополнить этот протокол с дополнительных или альтернативных нисходящие приложения после микроинъекции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Достижения в 3D культуры кишечных тканей, полученные через биопсии или генерируется из плюрипотентных стволовых клеток через направленного дифференцирования, привели к модели сложных в vitro слизистой оболочки кишечника. Используя эти новые модели систем потребует адаптации инструментов и методов, разработанных для систем 2D культуры и животных. Здесь мы опишем технику для измерения проницаемость эпителия барьер в человека кишечные organoids в реальном времени. Это достигается путем микроинъекции дневно меченых декстрана и изображений на инвертированным микроскопом с epifluorescent фильтрами. Реальном времени измерения проницаемости барьер в кишечных organoids облегчает поколения с высоким разрешением временных данных в тканях человека кишечного эпителия, хотя этот метод может быть применен также для фиксированной timepoint изображений подходы. Этот протокол является легко могут быть приспособлены для измерения проницаемость эпителия барьер после воздействия фармакологических агентов, бактериальных продуктов или токсинов или живые микроорганизмы. С незначительными изменениями этот протокол также может служить в качестве общего грунт на микроинъекции кишечных organoids и пользователи могут выбрать дополнить этот протокол с дополнительных или альтернативных нисходящие приложения после микроинъекции.

HIOs отличаются от человеческих плюрипотентных стволовых клеток и культивировали в ячейке матрицы решения как ранее описанных19,24. После 4 недель в культуре HIOs была расширена достаточно для микроинъекции. HIOs были microinjected с 4 кДа конъюгированных FITC декстрана в PBS или PBS, содержащие Clostridium difficile токсин TcdA приостановлено. C. difficile является оппортунистических желудочно-кишечного тракта возбудителя, что экспонаты токсин опосредованной эпителиальных токсичности в HIOs25. Как положительный контроль EGTA был добавлен в СМИ HIO культуры в подмножество HIOs вводят с PBS и FITC-декстрана. EGTA является кальций хелатором, что вызывает быстрое де полимеризации Цитоскелет актина42. FITC флуоресценции контролируется в режиме реального времени на живой изображения микроскопа в пределах контролируемой окружающей камеры и изображений были захвачены в 10-минутными интервалами.
Пост hoc анализ визуализации данных выявил существенные различия в сохранении FITC флуоресценции (рис. 5). HIOs вводят с PBS сохранил почти все флуоресцентного сигнала на t = 0, однако HIOs, которые также были введены с TcdA на лечение с EGTA выставлены существенное снижение интенсивности флуоресценции 8 часов после микроинъекции (Рисунок 5а). Визуализация данных были количественно для всех HIOs на все моменты времени для создания набора с высоким разрешением, представляющее относительные изменения в интенсивности флуоресценции со временем в каждом экспериментальном состоянии (Рисунок 5B). Различия в эпителиальной проницаемости были оценены путем расчета средней ликвидации время (t1/2 ) FITC для каждой группе лечения (Таблица 1) и сравнение различий между группами t t1/2 с помощью студента t-теста. Контроль лечение HIOs сохранил большинство FITC флуоресцентного сигнала для более чем 16 часов (t1/2 = 17 ± 0,3 ч). Лечение с EGTA значительно сократило время ликвидации FITC-декстран относительно управления HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1.3 x 10-8). В соответствии с ранее опубликованные результаты25, микроинъекции TcdA значительно увеличили проницаемость эпителия барьер относительно контроля лечения (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Таким образом внешние (EGTA) и microinjected (TcdA) соединения способны индуцировать значительные изменения в проницаемость эпителия барьер в HIOs. Эти результаты показывают, что воздействие широкий спектр фармакологических агентов, метаболитов, бактериальных продуктов, цитокины, факторы роста и других соединений на эпителиальные барьерной функции может оцениваться с использованием этого подхода.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Лечение</td>
			<td>Период полураспада (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Ниже 95% CI (h)</td>
			<td>Верхняя 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Управления</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: среднее время ликвидации (t1/2) для FITC-декстрана в HIOs лечение с EGTA или TcdA. Часов после микроинъекции единицы.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Рисунок 1: базовый макет microinjector и микроманипулятор для HIO микроинъекции. Это изображение показывает полный состав оборудования, используемого для выполнения микроинъекции HIOs. Ключевые компоненты помечены и упорядочение информации можно найти в таблице материалы. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Рисунок 2: съемник микропипеткой. Медь, Отопление катушки hc, верхнего прижима c1, нижний зажим (c2), съемник руку (ПА), тепло выбор переключения (ht) обозначаются стрелками. Правильную настройку для тепла 1 и ТЯНУТЬ указаны в красный текст. Врезные показывает правильно установлены стекловолокном готова для отопления. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Рисунок 3: представитель изображения тканей, полученных HIO вводят с FITC-декстрана. (A) изображения, демонстрируя позиционирования стекла микрокапиллярной просто до вставки в HIO и микроинъекции. (B) Brightfield изображения тканей производные человека кишечные organoids после микроинъекции FITC-декстрана. Обратите внимание, что сигнал флуоресценции очевидно даже без использования специального фильтра набора. Эта окраска СПИДа микроинъекции точности. 3 кратном <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Рисунок 4: Live визуализации процесса. (A) скриншот иллюстрирует шаги, необходимые для параметров Микроскоп, найти HIOs на слайде и сохранить позицию сцену для каждого HIO к записи образа. (B) предварительной визуализации параметров для захвата FITC канала на регулярной основе в каждой из позиций указаны в а. (C) после визуализации экспорта DV формат данных файлы TIFF изображений с одно изображение TIFF на HIO на момент времени.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Рисунок 5: представитель результаты. (A) стволовых клеток получены человека кишечные organoids (HIO) microinjected с 2 мг/мл FITC-декстрана (4 кДа) образы на 20 часов. HIOs также были microinjected с PBS (управления) или Clostridium difficile токсин TcdA (12,8 нг/мкл) или лечение с 2 мм, EGTA добавлены внешних носителей культуры. 4 крат. (B) сюжет интенсивности среднее нормализованных FITC со временем в HIOs лечение с PBS (управления), TcdA или EGTA. Планки погрешностей представляют S.E.M. и n = 11 HIOs (контроль), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Этот протокол описывает измерение проницаемость эпителия барьер в реальном времени следующие фармакологического лечения человека кишечные organoids с помощью флуоресцентной микроскопии и жить микроскопии клетки.

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Иммуно люминесцентные маркировки микротрубочек и Centrosomal белков в Ex Vivo кишечных тканей и 3D в Vitro кишечных Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Биолюминесценция в режиме реального времени Визуализация динамики сигнализации во время Нейрогенеза Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Повторяя сосание к отнятию Переход в пробирке с использованием плода кишечных органоидов

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Поколение человека iPSC основе крови мозга барьер чип

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...