Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Författarna vill tacka Drs. Stephanie Spohn och Basel Abuaita för många användbara diskussionerna om organoid Mikroskop. JRS stöds av Intestinal Stem Cell Consortium (U01DK103141), ett forskningssamarbete projekt finansierat av det nationella institutet för Diabetes och mag och njure sjukdomar (NIDDK) och nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID). JRS och VBY stöds av NIAID romanen, alternativ modellsystem för inlåtande sjukdomar (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH stöds mekanismer av mikrobiell patogenes utbildning bidraget från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID, T32AI007528) och klinisk och translationell Science award till Michigan Institutet för klinisk och hälsa Forskning (UL1TR000433).
Komplett datafiler och data analys-kod som används i detta manuskript finns på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter för att avslöja.

Detta protokoll fastställs en general-purpose metod för Mikroskop hPSC-derived HIOs och vävnad-derived intestinal organoids och mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid. Vi har också visat vår inställning till analys och tolkning av de data som genereras med hjälp av dessa metoder. Med tanke på växande antagandet av intestinal organoids modellsystem16,20,21,28 och den långvariga intressen tarmbarriären permeabilitet som en fysiologiskt relevanta funktionella resultatet3,4,5,6, vi räknar med att andra som arbetar inom detta område kommer att kunna tillämpa och bygga vidare på dessa metoder.
I området i närheten finns det flera steg som är avgörande för tillämpningen av denna teknik. Tillgång till högkvalitativa hPSC- eller vävnad härledda HIO vävnad bör fastställas innan omfattande experimenterande med Mikroskop. HIO Makrostrukturell kan vara heterogen, med variation i både storlek och form, även om vävnad identitet och cellulära morfologi är mycket reproducerbara när utnyttja etablerad metodik för att generera HIOs24. Sfäriska HIOs bestående av en enda halvtransparent lumen och mäter cirka 1 mm i diameter är idealiska för Mikroskop och mätning av luminala fluorescens i realtid. I vissa fall misslyckas Mikroskop, vilket leder till kollaps av HIO eller uppenbara läckage av injicerade material. Misslyckade HIOs kan tas bort från kulturen väl efter användarens gottfinnande använder en standard mikropipett. Överväga objektiv som är tillgänglig på en tänkbar plattform när du väljer HIOs för Mikroskop och imaging. I allmänhet 2-4 X objektiv är idealisk för att fånga komplett HIO fluorescerande signalen, även ett 10 X-objektiv kan användas om strömsnål linser inte är tillgänglig eller om de tillgängliga HIOs är &#60; 1 mm i diameter. Tänkbar mjukvaran måste tillåta automatisk avskiljning av fluorescerande bilder på definierade punkter över tid.
Flera ändringar i detta protokoll är möjligt för att passa de experimentella krav. Exempelvis resultaten av tester av barriär kan vara beroende av föreningarna i användning43 molekylär storlek och det kan vara lämpligt att testa dextran preparat med varierande molekylvikt. Brightfield avbildning kan dessutom utföras utöver fluorescens imaging som en indikator på den övergripande strukturella integriteten av vävnad25. När du utför Mikroskop levande bakterier25,28,31,32,33,44, det kan vara nödvändigt att lägga till penicillin och streptomycin eller gentamicin till HIO kultur media före eller efter Mikroskop. Utsidan av microcapillary kommer att kontamineras vid fyllning med bakteriekultur fjädring och detta kan överföras till HIO media. Växelvis, Mikroskop kan utföras på HIOs upphängd i extracellulär matrix (t.ex. Matrigel) utan media, att lägga till media efter Mikroskop är klar. Detta kan begränsa förorening till extracellulära matrix och externa ansikte av HIO. När du planerar mikrobiell tillväxt analyser, kan man behöva ta antibiotika i media efter 1-2 h för att undvika bromsa eller förhindra tillväxt av microinjected organismer.
Slutligen är inser att inte alla forskare kommer att ha tillgång till mikroskopi utrustning lämpar sig för in vitro- imaging, det viktigt att påpeka att de procedurer som beskrivs i detta protokoll för datainsamling fluorescens kan tillämpas på bilder tagna vid fasta tidpunkter använder standard epifluorescerande mikroskopi utan automatiserad bild fånga eller miljökontroll. Exempel på detta tillvägagångssätt kan hittas i betänkandena av Leslie och Huang et al. 25, som undersökte C. difficile toxin aktivitet i hPSC-derived intestinal organoids och Karve och Pradan o.a. 44, som undersökte epiteliala barriären permeabilitet i liknande hPSC-derived intestinal organoids microinjected med levande E. coli. Manuell manövrering av bildåtergivningsutrustning kan resultera i större variation och svårigheter i normalisera fluorescerande signalen. När utför manuell avbildning av FITC-dextran injiceras HIOs är det väsentligt att upprätthålla en fast förstoring, fluorescerande excitation intensitet och exponeringstider i hela experimentet att undvika snedvridande fluorescerande intensitet mätningarna.

Intestinal epitel bildar en selektiv barriär som medierar riktad transport av näringsämnen, H2O, joner och slaggprodukter samtidigt minimera ospecifik diffusion-medierad utbyte av andra partiklar mellan lumen och den mesenkymala vävnader och allt blod leverans1,2. Ospecifik genomträngligheten av epitelial tarmbarriären har länge ansetts vara en funktionell nyckelparameter i hälsa och sjukdom3,4,5,6, som återspeglar graden av spridning av små molekyler över epitelet via det paracellular utrymmet. Mätning av epiteliala barriären permeabilitet kan utföras på djur modeller7 och i mänskliga patienter8 genom intag av Laktulos, som har inga specifika transportör i mag-tarmkanalen, och den efterföljande samlingen och mätning av Laktulos koncentrationer i perifert blod. Alternativa intagna markörer för barriärfunktion såsom fluorescently märkt kolhydrater är också tillgänglig9,10. Detta tillvägagångssätt har anpassats för tarmens epitelceller kulturer odlas på Transwell stöder11, en förenklad metod som möjliggör större experimentell kontroll men har också kritiserats som en dålig prediktor för i vivo permeabilitet på grund av avsaknad av differentierade epitelceller subtyper och vävnad struktur12. Med kammare representerar ännu ett annat tillvägagångssätt och möjliggör mätning av epitelial barriärfunktion i hela tarmslemhinnan ex vivo13. Tillämpningen av denna teknik begränsas ofta av vävnad tillgänglighet och villkor13,14. Således behövs nya metoder som balanserar reproducerbarhet och genomströmning fysiologiska betydelse.
Senaste utvecklingen i in vitro- organogenesen har lett till antagandet av 3D vävnadsodling modellsystem som en sofistikerad plattform för går igenom dynamiken i komplexa vävnader15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. I synnerhet mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) härrör human intestinal organoids (HIOs)19,24 har dykt upp som reproducerbara och experimentellt eftertraktansvärda modellsystem för att studera värd-mikrobiella interaktioner och epiteliala barriären dynamics25,26,27,28. Likaså, mänsklig vävnad-derived organoids (även känd som enteroids) kan härledas från en enkel biopsi förfarande och kan användas som ett fogligt system för att studera människans fysiologi och sjukdom15,29,30. Mikroskop av human intestinal organoids möjliggör leverans av experimentella föreningar25 eller levande mikrober25,31,32,33 till de apikala epitelial yta av organoid lumen. Leslie och Huang et al. 25 nyligen anpassat denna teknik för att mäta barriär permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) märkt dextran efter exponering för bakteriella toxiner.
Detta protokoll är avsedd som en vägledning för mätning av epiteliala barriären permeabilitet i hPSC-derived HIOs och vävnad-derived HIOs använder fluorescerande mikroskopi. Med smärre ändringar, kan det också fungera som en allmän primer på Mikroskop av HIOs med experimentella föreningar. Användare kan komplettera detta protokoll med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Framsteg inom 3D kultur av intestinal vävnader erhålls genom biopsi eller genereras från pluripotenta stamceller via riktad differentiering, har resulterat i sofistikerade in vitro- modeller av tarmslemhinnan. Att utnyttja dessa framväxande modellsystem kräver anpassning av verktyg och tekniker som utvecklats för 2D kultur system och djur. Här, beskriver vi en teknik för att mäta epiteliala barriären permeabilitet i human intestinal organoids i realtid. Detta sker genom Mikroskop fluorescently-märkt dextran och bildbehandling på ett inverterat Mikroskop som är utrustat med epifluorescerande filter. Realtid mätning av barriär permeabiliteten i intestinal organoids underlättar generationen högupplösta tidsmässiga data i human intestinal epitelvävnad, även om denna teknik kan också tillämpas på fast tidpunkt imaging metoder. Detta protokoll är lätt anpassningsbar för mätning av epiteliala barriären permeabilitet efter exponering för farmakologiska agenter, bakterieprodukter eller toxiner eller levande mikroorganismer. Med smärre ändringar, detta protokoll kan också fungera som en allmän primer på Mikroskop av intestinal organoids och användare kan välja att komplettera protokollet med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.

HIOs var åtskilt från mänskliga pluripotenta stamceller och odlade i cellen matris lösning som tidigare beskrivits19,24. Efter 4 veckor i kultur, hade HIOs expanderat tillräckligt för att möjliggöra Mikroskop. HIOs var microinjected med 4 kDa FITC-konjugerad dextran upphängd i PBS eller PBS som innehåller Clostridium difficile toxin TcdA. C. difficile är en opportunistisk gastrointestinala patogen som uppvisar toxin-medierad epitelial toxicitet i HIOs25. Som positiv kontroll lades EGTA till HIO kultur media i en delmängd av HIOs injiceras med PBS och FITC-dextran. EGTA är en kalcium kelator som orsakar snabb avinstallation polymerisation av aktin cytoskelettet42. FITC fluorescens var övervakas i realtid på ett levande imaging Mikroskop inom en kontrollerade klimatkammare och bilder fångades i 10 minuters mellanrum.
Post-hoc analys av imaging data visade betydande skillnader i lagring av FITC fluorescens (figur 5). HIOs injiceras med PBS kvar nästan alla av de fluorescerande signalen som är närvarande vid t = 0, men HIOs som injicerades också med TcdA av behandlade med EGTA uppvisade en betydande minskning av fluorescerande intensitet av 8 timmar efter Mikroskop (figur 5a). Imaging data kvantifierades för alla HIOs vid alla tidpunkter att generera en högupplöst datamängd som representerar den relativa förändringen i fluorescerande intensitet över tid i varje experimentella villkor (figur 5B). Skillnader i epitelial permeabilitet utvärderades genom att beräkna genomsnittlig eliminering tiden (t1/2 ) av FITC för varje behandlingsgrupp (tabell 1) och jämföra skillnader i t t1/2 mellan grupper med hjälp av Students t-test. Kontroll-behandlade HIOs behöll majoriteten av FITC fluorescerande signalen mer än 16 timmar (t1/2 = 17 ± 0.3 h). Behandling med EGTA signifikant FITC-dextran eliminering tid relativt kontrollen HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Med tidigare publicerade resultat25, Mikroskop av TcdA betydligt ökad epiteliala barriären permeabilitet i förhållande till kontroll behandling (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Således är både externa (EGTA) och microinjected (TcdA) föreningar kan framkalla betydande förändringar i epiteliala barriären permeabilitet i HIOs. Dessa resultat tyder på att effekterna av ett brett utbud av farmakologiska agenter, metaboliter, bakterieprodukter, cytokiner, tillväxtfaktorer och andra föreningar på epitelial barriärfunktion kan utvärderas med hjälp av denna metod.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandling</td>
			<td>Halveringstid (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Lägre 95% CI (h)</td>
			<td>Övre 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontroll</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7,56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9,18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: genomsnittlig eliminering (t1/2) för FITC-dextran i HIOs behandlas med EGTA eller TcdA. Enheter är timmar efter Mikroskop.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figur 1: grundläggande layouten av en microinjector och micromanipulator för HIO Mikroskop. Denna bild visar det kompletta komplementet av utrustning som används för att utföra Mikroskop av HIOs. Viktiga komponenter är märkta och beställningsinformation kan hittas i tabellen material. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figur 2: mikropipett avdragare. Den koppar värme spole hc, övre klämma c1, botten klämman (c2), avdragare arm (pa), värme urval växla (ht) identifieras med pilarna. Rätt inställning för HEAT 1 och PULL indikeras i röd text. Infällt visar en korrekt monterade glas glödtråd redo för uppvärmning. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figur 3: representativa bilder av en vävnad-derived HIO injiceras med FITC-dextran. (A) bild visar placeringen av glas microcapillary strax före införande i HIO och Mikroskop. (B) Brightfield bild av en vävnad-härledda mänskliga intestinal organoids efter Mikroskop av FITC-dextran. Observera att fluorescens signalen är uppenbara även utan användning av ett specifikt filter set. Denna färg hjälpmedel Mikroskop precision. 3 X förstoring <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figur 4: Live imaging arbetsflöde. (A) skärmdump illustrera stegen för att ange parametrarna Mikroskop, hitta HIOs på bilden och spara positionen för scenen för varje HIO att avbildas. (B) pre imaging inställningar för att fånga FITC kanalen med jämna mellanrum på respektive befattning som anges i A. (C) efter imaging export av DV formatdata filer som TIFF-bilder med en TIFF-bild per HIO per tidpunkt.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figur 5: representativa resultat. (A) stamceller-derived human intestinal organoids (HIO) microinjected med 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) avbildas i 20 timmar. HIOs var också microinjected med PBS (kontroll) eller Clostridium difficile toxin TcdA (12,8 ng/µL) eller behandlats med 2 mM EGTA tillsätts med de externa kultur media. 4 X förstoring. (B) handlingen i genomsnittlig normaliserad FITC intensitet över tid i HIOs behandlas med PBS (kontroll), TcdA eller EGTA. Felstaplar representera S.E.M. och n = 11 HIOs (kontroll), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Detta protokoll beskriver mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid efter farmakologisk behandling i human intestinal organoids använder fluorescerande mikroskopi och levande cell mikroskopi.

Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Mätning och Real Time Visualisering av somatiska Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknik för primär mus intestinal Organoider med hjälp av magnetiska nanopartikel Transduction virala vektorer för frysta snittning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Real tid bioluminescence avbildning av notch signalering dynamik under Murine neurogenes

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating Suckling till avvänjning övergång in vitro med fetala intestinala Organoider

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In vitro-kultur av epitelceller från olika anatomiska regioner i det mänskliga fosterhinnan

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Generation av en mänsklig iPSC-baserade Blod-Brain Barriär Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...