Name: real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Yazarlar Drs. Stephanie Spohn ve Basel Abuaita organoid mikroenjeksiyon birçok yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Solumasını bağırsak kök hücre Konsorsiyumu (U01DK103141), diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) ve Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) tarafından finanse edilen bir ortak araştırma projesi tarafından desteklenir. Solumasını ve VBY NIAID roman, alternatif Model sistemleri için enterik hastalıklar (NAMSED) Konsorsiyumu (U19AI116482) tarafından desteklenmektedir. DRH desteklenmektedir mikrobiyal Patogenez mekanizmaları eğitim hibe Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIAID, T32AI007528) ve klinik ve çevirim Bilim Ödülü Michigan Enstitüsü Klinik ve sağlık için Araştırma (UL1TR000433).
Tam veri dosyaları ve bu el yazması kullanılan veri analizi kodu https://github.com/hilldr/HIO_microinjection mevcuttur.

<ol>
	<li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease.">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porous+defense:+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease.">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+A+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li><li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat.">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li><li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease.">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li><li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability+measurements:+General+aspects+and+possible+pitfalls.">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li><li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line:+T84+intestinal+epithelial+cells.">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li><li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability:+A+critique.">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li><li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability.">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li><li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Ussing's+chambers:+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport.">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li><li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids.">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue.">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+grow+a+lung:+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li><li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li><li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+new+ball+game:+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions.">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/Colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface.">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+clostridium+difficile+infection:+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile.">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li><li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).</li><li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Western blotting: Methods and protocols. , (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+imageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+language+and+environment+for+statistical+computing.">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2017).</li><li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).</li><li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization.">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li><li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+the+assessment+of+intestinal+permeability,+size+matters.">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları ifşa etmek var.

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak hPSC elde edilen HIOs ve bağırsak organoids doku kaynaklı mikroenjeksiyon ve epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için genel amaçlı bir yöntem oluşturur. Biz de analiz ve bu yöntemleri kullanan oluşturulan verilerin yorumlanması bizim yaklaşım göstermiştir. Bağırsak organoids büyüyen kabulü model sistemleri verilen16,20,21,28 ve fonksiyonel bağırsak bariyer geçirgenliği gibi fizyolojik ilgili uzun süredir ilgi sonuç3,4,5,6, biz diğerleri bu alanda çalışan uygulamak ve bu yöntemler kurmak mümkün olacak tahmin.
Bu teknik uygulama için kritik olan birkaç adım vardır. Yüksek kalite hPSC - veya türetilmiş HIO doku mikroenjeksiyon ile kapsamlı deneme önce kurulmalıdır doku erişim. Doku kimlik ve hücresel Morfoloji olmasına rağmen son derece tekrarlanabilir HIOs24üretmek için kurulan metodoloji kullanan zaman HIO macrostructure hànzú, her iki boyutu ve şekli, varyasyon ile olabilir. Tek bir yarı saydam Lümen oluşan ve yaklaşık 1 mm çapında ölçme küresel HIOs mikroenjeksiyon ve gerçek zamanlı olarak luminal Floresans ölçümü için idealdir. Bazı durumlarda, mikroenjeksiyon, HIO çöküşü enjekte malzeme açık kaçağı sonuçlanabilecek başarısız olur. Başarısız HIOs-ebilmek var olmak çıkarmak ile kültür de kullanıcının isteği doğrultusunda standart bir micropipette kullanarak. Objektif lensler bir görüntüleme platformu üzerinde kullanılabilir HIOs mikroenjeksiyon ve görüntüleme için seçerken göz önünde bulundurun. 10 X amaç düşük güç lensler kullanılabilir değilse veya mevcut HIOs varsa kullanılabilir, ancak genel olarak, 2-4 X objektif lens tam HIO floresan sinyal yakalamak için idealdir &#60; 1 mm çapında. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı için tanımlanmış noktalarda floresan görüntülerin otomatik yakalama zaman içinde izin vermeniz gerekir.
Bu protokol birçok değişikliği deneysel gereksinimlerine uymak için mümkündür. Örneğin, bariyer fonksiyonu testlerinin sonuçlarını kullanım43 bileşiklerin moleküler boyutu bağımlı olabilir ve değişen molekül ağırlığı dextran hazırlıkları test etmek uygun olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan görüntüleme Floresans görüntüleme doku25genel olarak yapısal bütünlüğünü bir göstergesi olarak ek olarak gerçekleştirilebilir. Canlı bakteri25,28,31,32,33,44mikroenjeksiyon işlemi sırasında penisilin eklemek gerekli olabilir ve streptomisin veya gentamisin önce veya sonra mikroenjeksiyon HIO kültür medyaya. Microcapillary dışına doldurma ile bakteri kültürü Süspansiyon sırasında kontamine ve bu HIO medyaya devredilebilir. Alternatif olarak, mikroenjeksiyon mikroenjeksiyon tamamlandıktan sonra medya ekleme medya, hücre dışı Matriks (örneğin, Matrigel) askıya HIOs üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu kirlenme hücre dışı matriks ve dış yüzü HIO sınırlayabilir. Mikrobiyal büyüme deneyleri planlarken, antibiyotik medyada yavaşlama veya microinjected organizmaların büyümesini engelleyerek önlemek için 1-2 h sonra kaldırmak gerekli olabilir.
Son olarak, tüm araştırmacılar mikroskobu ekipman vitro görüntüleme için uygun erişimi kabul ederek, Floresans veri toplamak için bu protokolü bölümünde özetlenen yordamlar çekilen görüntülere uygulanabilir işaret etmek önemlidir otomatik görüntü yakalama veya çevresel kontroller standart epifluorescent mikroskobu kullanarak sabit timepoints. Bu yaklaşımın örnekleri raporlarda Leslie ve Huang vd tarafından bulunabilir C. difficile toksin aktivite bağırsak organoids hPSC elde edilen Karve ve Pradan ve ark. , muayene 25, epitel bariyer geçirgenliği ile canlı E. colimicroinjected benzer hPSC elde edilen bağırsak organoids içinde muayene 44. Ekipman görüntüleme el ile işlem daha fazla değişim ve floresan sinyal normalize zorluk neden olabilir. El ile görüntüleme FITC dextran performans HIOs enjekte edildiğinde sabit büyütme, floresan uyarma yoğunluğu ve pozlama süreleri floresan yoğunluk ölçümleri bozan önlemek için deney boyunca korumak için önemlidir.

Bağırsak epitel besinler, H2O, iyonlar ve atık ürünler yönlü taşımacılığının diğer parçacıklar Lümen arasında Difüzyon-aracılı nonspesifik alışverişini en aza indirerek aracılık eder seçici bir bariyer oluşturur ve Mezenkimal doku veya kan kaynağı1,2. Bağırsak epitel bariyer nonspesifik geçirgenliği uzun oranı yansıtan sağlık ve hastalık3,4,5,6, bir anahtar işlev parametre kabul edilmiştir Difüzyon yolu ile paracellular alan epitel boyunca küçük moleküllerin. Epitel bariyer geçirgenliği ölçümü içinde yürütülen hayvan modelleri7 ve insan hasta8 ' de laktuloz sindirim yoluyla, gastrointestinal sistem ve sonraki koleksiyonu belirli hiçbir ışınlama sahip olduğu ve laktuloz konsantrasyonlarda periferik kan ölçümü. Alternatif alınan işaretleri fluorescently etiketli karbonhidratlar gibi bariyer fonksiyonunun da mevcut9,10vardır. Bu yaklaşım Transwell destekler11, daha fazla deneysel kontrol için izin verir, ancak aynı zamanda içinde vivo zavallı bir tahmin eleştirilmiştir basitleştirilmiş bir yaklaşım üzerinde yetiştirilen bağırsak epitel hücre kültürleri için adapte edilmiş geçirgenliği farklılaştırılmış epitel alt türlerini ve doku yapısı12yokluğu nedeniyle. Chambers'ı kullanarak yeni bir yaklaşım temsil ve epitel bariyer fonksiyonu tüm bağırsak mukoza ex vivo13' te ölçümü için izin verir. Bu tekniğin uygulanması sık doku kullanılabilirlik durumu13,ve14tarafından sınırlıdır. Böylece tekrarlanabilirlik ve işlem hacmi fizyolojik alaka ile dengeleyen yeni yöntemler gereklidir.
Vitro organogenesis son gelişmeler 3D doku kültürü model sistemleri kabulü karmaşık doku15,16,17 dinamikleri recapitulating için sofistike bir platform olarak yol açmıştır ,18,19,20,21,22,23. Özellikle, insan pluripotent kök hücre (hPSC) elde edilen insan bağırsak organoids (HIOs)19,24 konak-mikrobiyal etkileşim incelenmesi için bir tekrarlanabilir ve deneysel olarak uysal modeli sistem olarak çıkmıştır ve epitel bariyer dynamics25,26,27,28. Benzer şekilde, insan doku kaynaklı organoids (enteroids olarak da bilinir) bir basit biyopsi yordamla elde ve uysal bir sistem olarak insan fizyolojisi ve hastalık15,29,30eğitim için kullanılabilir. İnsan bağırsak organoids mikroenjeksiyon deneysel bileşikler25 teslimi için izin verir veya mikropların25,31,32,33 ' e apikal epitel yaşamak organoid Lümen yüzeyine. Leslie ve Huang vd. 25 son zamanlarda bakteriyel toksinler maruz takip dextran etiketli floresein isothiocyanate (FITC) ile microinjected HIOs bariyer geçirgenliği ölçmek için bu tekniği adapte.
Bu iletişim kuralı hPSC elde edilen HIOs ve floresan mikroskopi kullanarak doku kaynaklı HIOs epitel bariyer geçirgenliği ölçüm için bir kılavuz olarak hazırlanmıştır. Küçük değişiklikler ile o da HIOs mikroenjeksiyon deneysel bileşikler ile genel bir astar olarak hizmet verebilir. Kullanıcılar bu iletişim kuralı ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile mikroenjeksiyon sonra ek.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0)</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>405200081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell matrix solution (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deltavision RT live cell imaging system</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>softWoRx Imaging software</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Cell Logic+</td>
			<td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-3C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UM-1PF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Holder</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>UP-1</td>
			<td>Alternate to Xenoworks pipette holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narshge</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SX61</td>
			<td>Recommended scope, although other models are likely compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP HQ2</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>29065728</td>
			<td>Included with Deltavision system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8619-GT-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>4645-RS</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td>Component of ENR media; see McCraken et al. 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran (4 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-MH2</td>
			<td>Preferred device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Tubing kit</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>BR-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 in clear ferrule</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V001104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-1.2 mm O-ring</td>
			<td>Xenoworks</td>
			<td>V300450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids

Biyopsi ile elde edilen veya pluripotent kök hücreler yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla üretilen bağırsak dokuların 3D kültür gelişmeler bağırsak mukoza sofistike vitro modellerinde sonuçlandı. Ortaya çıkan bu model sistemleri yararlanarak araçlar ve teknikler 2D kültür sistemleri ve hayvanlar için geliştirilen uyum gerektirir. Burada, gerçek zamanlı olarak insan bağırsak organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçüm tekniği tarif. Bu mikroenjeksiyon fluorescently etiketli dextran ve görüntüleme epifluorescent filtre ile donatılmış bir ters mikroskop Tarih tarafından gerçekleştirilir. Bu teknik aynı zamanda yaklaşımlar Imaging sabit timepoint birlikte gerçek zamanlı bağırsak organoids bariyer geçirgenliği ölçümü insan bağırsak epitel dokusu, yüksek çözünürlüklü zamansal veri nesil kolaylaştırır. Farmakolojik ajanlar, bakteriyel ürünler veya toksinler veya canlı mikroorganizmalar maruz kalma takip epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için kolayca uyarlanabilir bir protokoldür. Küçük değişikliklerle bu protokolü de bağırsak organoids mikroenjeksiyon genel bir astar olarak hizmet verebilir ve kullanıcılar bu protokolü mikroenjeksiyon aşağıdaki ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile tamamlamak tercih edebilir.

HIOs insan pluripotent kök hücreleri ayrıştırılan ve hücre matris çözüm olarak daha önce açıklanan19,24kültürlü. Kültür 4 hafta sonra HIOs mikroenjeksiyon için izin vermek için yeterince genişletti. HIOs 4 kDa FITC Birleşik dextran PBS veya Clostridium difficile toksin TcdA içeren PBS askıya ile microinjected. C. difficile HIOs25epitel toksisite toksin-aracılı sergileyen bir fırsatçı gastrointestinal hastalık var. Pozitif kontrol, EGTA bir alt kümesini PBS ve FITC dextran ile enjekte HIOs HIO kültür medyada eklenmiştir. EGTA hızlı de-polimerizasyon aktin sitoiskeleti42neden olur bir kalsiyum şelatör var. FITC Floresans gerçek zamanlı canlı görüntüleme mikroskop içinde kontrollü bir çevre odası olarak izlenmeli ve görüntüleri 10 dakikalık aralıklarla ele geçirildi.
Görüntüleme veri Post-hoc çözümlemesi FITC floresan (şekil 5) tutma önemli farklılıkları ortaya koydu. PBS ile enjekte HIOs muhafaza neredeyse tüm floresan sinyal t mevcut Ayrıca TcdA ile EGTA ile tedavi enjekte edildi HIOs 8 saat sonrası mikroenjeksiyon (şekil floresan yoğunluğu önemli bir düşüş sergiledi ancak = 0, 5A). görüntüleme veri göreceli değişiklik floresan yoğunluğu zamanla deneysel her durumda (şekil 5B) temsil eden yüksek çözünürlüklü bir veri kümesi oluşturmak tüm HIOs tüm zaman noktalarda için sayısal. Epitel geçirgenliği farklılıkları her tedavi grubu (Tablo 1) FITC (t1/2 ) ortalama eliminasyon zaman hesaplama ve t t1/2 gruplar arasındaki farkları karşılaştırarak değerlendirildi kullanarak öğrenci t-test. Denetimi değerlendirilmesi HIOs muhafaza FITC floresan sinyal 16 saatten fazla çoğunluğu (t1/2 = 17 ± 0,3 h). EGTA ile tedavi azaltılacağını FITC dextran eleme zaman denetime HIOs göre (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h; P = 1.3 x 10-8). Daha önce yayımlanmış sonuçları25ile tutarlı, TcdA mikroenjeksiyon önemli ölçüde epitel bariyer geçirgenliği kontrol tedavi göre artar (t1/2 = 7,6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). Böylece, dış (EGTA) ve microinjected (TcdA) bileşikleri HIOs epitel bariyer geçirgenliği içinde önemli değişiklikler inducing yeteneğine sahiptirler. Bu sonuçlar epitel bariyer fonksiyonu çok çeşitli farmakolojik ajanlar, metabolitleri, bakteriyel ürünleri, sitokinler, büyüme faktörleri ve diğer bileşikler etkileri bu yaklaşımı kullanarak değerlendirilecek öneririz.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tedavi</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>% 95 CI (h) indir</td>
			<td>Üst %95 CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denetim</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16,45</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3,38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9,18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: demek eleme zaman (t1/2) FITC-dextran HIOs içinde EGTA veya TcdA ile tedavi için. Saat sonrası mikroenjeksiyon birimleridir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Şekil 1: microinjector ve micromanipulator HIO mikroenjeksiyon için temel düzenini. Bu görüntü cihazları HIOs mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için tam tamamlayıcı gösterir. Anahtar bileşenleri olarak etiketlenir ve sipariş bilgileri malzemeleri tablosunda bulunabilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Resim 2: Micropipette çektirme. Bakır bobin hc, üst kelepçe c1, alt kelepçe (c2), Isıtma çektirme kol (pa), ısı Seçimi Değiştir (ht) oklarla tanımlanır. Doğru ayarlar için ısı 1 ve çekme kırmızı metin olarak gösterilir. İlave bir doğru şekilde monte edilmiş cam filament Isıtma için hazır gösterir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Şekil 3: FITC-dextran ile enjekte bir doku kaynaklı HIO temsilcisi görüntülerini. (A)görüntü cam microcapillary hemen önce HIO ve mikroenjeksiyon içine ekleme konumlandırma gösteren. (B) bir doku elde edilen insan bağırsak organoids FITC dextran mikroenjeksiyon sonra aydınlık alan görüntü. Floresans sinyal bile bir süzgeç kümesi kullanımı belirgin olduğunu unutmayın. Bu renklendirme mikroenjeksiyon hassas yardımcı olur. 3 X büyütme <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Şekil 4: görüntüleme iş akışı yaşamak. (A)mikroskop parametrelerini ayarlamak slayt üzerinde HIOs bulup her HIO yansıması için sahne konumunu kaydetmek gereken adımları gösteren ekran görüntüsü. (B) öncesi görüntüleme ayarları her konumları düzenli aralıklarla FITC kanal yakalamak için DV formatında veri A. (C) sonrası görüntüleme dışa aktarma işlemine belirtilen dosyaları TIFF görüntüleri ile her zaman noktası HIO başına bir TIFF görüntü olarak.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Şekil 5: temsilcisi sonuçları. (A)kök hücre elde edilen 2 mg/mL ile FITC dextran microinjected insan bağırsak organoids (HIO) (4 kDa) görüntüsü 20 saattir. HIOs da PBS (kontrol) veya Clostridium difficile toksin TcdA ile microinjected (12,8 ng/µL) veya 2 EGTA dış kültür ortamına eklenen mM ile tedavi. 4 X büyütme. (B) arsa zaman HIOs içinde ortalama normalleştirilmiş FITC yoğunluğunun PBS (kontrol), TcdA veya EGTA ile tedavi. Hata çubukları temsil S.E.M. ve n = 11 HIOs (kontrol), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Fetal Intestinal Organoidler Kullanılarak Tüp Bebek Teyidi--Weaning Geçiş

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...