Name: large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies at JoVE.com

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra en rekke kilder, inkludert UK Engineering og Physical Sciences Research Council (gi refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) og en utdannet studentship for JH; Leverhulme tillit (RPG-2014-292); Wellcome Trust institusjonell strategisk støtte fondet (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); og ved University of Manchester for et universitet Manchester Research Institute (UMRI pumpe grunning fund) og en Presidential doktorgrad stipend til SW. teknisk assistanse av Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) er også takknemlig anerkjent.

<ol>
	<li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Strategies+in+Nanolithography.">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).</li><li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Approaches+to+Nanofabrication:+Molding,+Printing,+and+Other+Techniques.">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li><li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Scanning+Probe+Lithography.">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li><li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-Pen"+Nanolithography.">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography.">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fountain+Pen+Nanochemistry:+Atomic+Force+Control+of+Chrome+Etching.">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li><li>Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution.">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li><li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid:+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles.">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li><li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays.">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li><li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Pen+Lithography.">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li><li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hard-Tip,+Soft-Spring+Lithography.">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Force-Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography.">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li><li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Scanning+Probe+Nanolithography+Facilitated+by+Automated+Alignment+of+Probe+Arrays.">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li><li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multipoint+Force+Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography.">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li><li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder.">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li><li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-Bioelectronics+via+Dip-Pen+Nanolithography.">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li><li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate.">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li><li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography.">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices.">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography.">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li><li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+"Dip+Pen+Nanolithography".">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Metal+Nanowires+Using+Microcontact+Printing.">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li><li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates.">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li><li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour:+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine.">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).</li><li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography.">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li><li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins.">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li><li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography.">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li></ol>

Justering algoritme og programvaren ble utviklet av, og er eies, Universitetet i Manchester. Det er tilgjengelig for nedlasting på http://www.click2go.umip.com/.

Denne protokollen serverer å gi brukerne en praktisk metode for å raskt utføre nanolithographic mønstre med høy ensartethet og kontrollerbar mønsterstørrelsen over store (cm2) områder. Underlag bærer disse store området nanopatterns kan deretter bli ytterligere utdypes for en rekke applikasjoner. En stor anvendelse av denne teknologien er i generering av nanofabricated overflater for celle-overflate samhandling studier. Denne rapporten viser illustrerende eksempler med cellekulturer disse materialene, demonstrere kontroll over hMSC morfologi av nanofabricated underlag.
Avgjørende for denne protokollen er automatisering av justeringsprosedyren (trinn 4) som tillater svært ensartet og høy gjennomstrømming produksjon av funksjoner på overflater, ned nanoskala oppløsning, som muliggjør rask omsetning med cellekulturer eksperimenter. Den polymer penn litografi gjennomført med denne justeringen algoritmen er kjøpedyktig utvikle nanoskala funksjoner i ca 30 min. Reproduserbarhet og nøyaktigheten av automatisk justering, og dermed ensartetheten i mønstret funksjonene, er imidlertid kritisk avhengig av kvaliteten på sonde matriser som er produsert (trinn 1 og 2). Eventuelle feil i forberedelsen som resulterer i sløv, ødelagte eller manglende sonder; som fanget luft kan bobler (trinn 1.5) eller uriktig separasjon av sonder fra master (trinn 1.8) resultere i feil justering og dårlig kvalitet litografi.
Dette rapportert metoden aksjer en begrensning i likhet med andre justering metoder som er avhengige av force feedback. Nøyaktig bestemmelse av når sonder er i kontakt med overflaten er begrenset av behovet for å ta hensyn til bakgrunnen vibrasjoner forårsaket av ambient miljøet og bevegelse av prøven scenen. Generelt, sensorer har en force sensitivitet i µN regime (2 µN i dette tilfellet), men justering algoritmen er utformet for å bare registrere en styrke på minst 490 µN som endelig kontakt mellom sonder og overflaten, for å unngå eventuelle 'false positiv' resul ting fra bakgrunnsstøy. 13 derfor, denne metoden har en tendens til å produsere store funksjoner (1-2 µm) siden sonder må utvidet en stor avstand på z-aksen (med en påfølgende høyere styrke) for å registrere kontakt. For å kompensere, mindre funksjoner kan genereres ved å redusere z-aksen avstand reist under litografi trinnet (e.g.inn innstillingen "Svarte" i trinn 5.2.3.2 som 3 µm i stedet for 5 µm).
Likevel, selv med denne begrensningen automatisering algoritmen er stand til å ta en viktig del i anvendelsen av parallelized sonde litografi skannemetoder justering var tidligere mest tid krevende og upresise skritt i den implementering av disse teknikkene. Automatiseringen nå flytter hastighetsbegrensning trinnet av fabrikasjon prosessen fra justeringen av litografiske skrive selv. Mens denne protokollen demonstrerer bruken av denne justeringsprosedyren til PPL, kan rammen brukes til en rekke SPL teknikker som lipid-DPN26 og matrix-assistert litografi27 , samt mulige fremtidige katalytisk sonden systemer. 28

Fremgang i nanoteknologi er avhengig av utviklingen av teknikker i stand til å effektivt og pålitelig fabrikere nanoskala funksjoner på overflater. 1 , 2 imidlertid generere slike funksjoner over store områder (flere cm2) pålitelig og relativt lav kostnad er en ikke-triviell oppgave. De fleste eksisterende teknikker, avledet fra semiconductor industry, stole på ablative klima og jordsmonn å dikte "harde" materialer. Flere nylig, litografisk teknikker utledet fra skanning sonde mikroskopi (SPM) har dukket opp som en praktisk og allsidig tilnærming for rask prototyping nanoskala design. 3 SPM-baserte teknikker kan enkelt og raskt 'skrive' alle brukerdefinerte mønster. Den mest kjente av disse er dip-penn nanolithography (DPN), utviklet av Mirkin et al.,4 der en skanning probe brukes som en 'Penn' overføre en molekylær "blekk" til overflaten produsere funksjoner på en måte analog til skriving. Under forholdene, som en sonde er skannet på en overflate "blekk" molekylene er overført til den overflate via en vann menisk som danner mellom sonden og overflaten (figur 1). DPN dermed lar nanolithographic avsetning av en rekke materialer, inkludert "myke" materialer som polymerer og biomolecules. 5 relaterte teknikker bruker sonder konstruert med kanaler for væskestrømmen, blant annet referert til som "nanopipettes" og 'nano-fountain penner', har også blitt rapportert. 6 , 7 , 8
Den største hindringen til bredere anvendelse av SPM-avledet litografi er produksjon, som det krever en svært lang tid å mønster centimeter skala områder med en enkelt sonde. Tidlige forsøk på å løse dette problemet fokusert på parallelization av cantilever-baserte DPN, med både "en-dimensjonale" og "to-dimensjonale" (2D) sonde matriser rapporteres for litografi centimeter store områder. 5 , 9 men disse cantilever matriser er produsert gjennom relativt komplisert må fabrikasjon metoder og er relativt skjøre. Oppfinnelsen av polymer penn litografi (PPL) adressert dette problemet ved å erstatte de standard SPM utkragning med en 2D rekke myk siloxane elastomer sonder limt til et glass lysbilde. 10 enkle sonde installasjonen betydelig reduserer kostnadene og kompleksiteten av mønstre store områder, åpne opp nanolithography for flere programmer. Denne cantilever-fri arkitekturen har også blitt utvidet til hard-tip myk våren litografi,11 som gir en hybrid av myke cellegummi støtte vanskelig silisium tips gir forbedret oppløsning i forhold til mønstre produsert med myke elastomer tips.
En avgjørende faktor i utførelsen av disse 2D matrise teknologiene er at sonden matrisen må være nøyaktig parallell til overflaten underlaget slik at når litografi benyttes, alle sonder kommer i kontakt med overflaten samtidig. Selv en liten forskyvning kan føre til en stor aldersforskjell mønsterstørrelsen fra en side av matrisen til den andre, siden noen sonder komme i kontakt med overflaten tidligere under nedstigningen av array, mens andre vil komme i kontakt senere eller ikke i det hele tatt. 12 nøyaktig justering er spesielt viktig med PPL på grunn av deformability av myke elastomer sonder, der sonder kontakter overflaten tidligere komprimeres, forlate en større fotavtrykk på overflaten.
Det tidlige arbeidet på PPL ansatt rent visuell inspeksjon til justering prosessen, bruker et kamera montert over array for å observere deformasjon av pyramideformet sonder som de ble ført i kontakt med overflaten. 10 justeringen ble dømt av observere hvilken side av sonder kom i kontakt med overflaten først, og deretter justere vinkelen og gjenta prosedyren i en iterativ måte før forskjellen i kontakt på hver side av sonden var utvisket til øyet. Som denne justeringsprosedyren er avhengig av subjektive visuell inspeksjon av operatøren, er reproduserbarhet lav.
Deretter er en mer objektiv tilnærming utviklet, bestående av en kraft-sensor montert i substratet måle kraften ved kontakt av sonder på overflaten. 12 justeringen ble dermed oppnådd ved å justere tilt vinkler for å maksimere kraften, som indikerte at alle sonder hadde samtidig kontakt. Denne metoden viste at justeringen til innen 0.004° av overflaten parallell var mulig. Denne 'force feedback flate"er nå implementert i helautomatisk systemer i to uavhengige rapporter. 13 , 14 både bruke en triaden av force sensorer montert i substratet eller over matrisen og måle mengden av kraft ved kontakt mellom sonde matriser og overflaten. Disse gir høy presisjon, rapportering avvik ≤0.001 ° 1 cm lengde skala,14 eller ≤ 0.0003 ° over 1.4 cm.13 systemene automatisk justering gir også store besparelser i operatørtiden og totale tiden det tar å fullføre den Litografi prosessen.
En stor anvendelse av høy gjennomstrømming overflaten fabrikasjon aktiveres av denne teknologien er generasjon av celle kultur underlag. Det er nå godt etablert at cellen fenotypen kan manipuleres ved å kontrollere første samspillet mellom cellene og overflaten, og at dette kan forsterkes på nanoskala. 15 spesielt sonde litografi skannemetoder har vist seg å være en lettvint metode for å produsere en rekke nanofabricated overflater for slike cellekulturer eksperimenter. 16 For eksempel overflater presentere nanoskala mønstre selv montert monolayers og ekstracellulær matrix proteiner mal av PPL og DPN har blitt brukt til å studere potensialet i nano-endret materialer i materiale indusert differensiering av stamceller. 17
Denne protokollen beskriver bruken av et modifisert atomic force mikroskopet (AFM) system som gjør store området PPL. Vi detalj påvisning av kraft med flere makt sensorer som middel for å bestemme probe-overflate kontakt, sammen med en algoritme som automatiserer repeterende justering. Påfølgende functionalization av disse mønstrene med ekstracellulær matrix proteiner fibronectin og kultur menneskelige mesenchymal stamceller (hMSC) er beskrevet, som en demonstrasjon av PPL-fabrikkert flater brukes for cellekultur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZ&#920;&#934;) translation and goniometer stage</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>P40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM control software</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>C3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z225568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaFlo</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-FMG-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Dry Oxygen Service Pump</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-OPE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ015WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Humidity Generator</td>
			<td>proUmid</td>
			<td>MHG32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline Plus Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon masters</td>
			<td>NIL Technology</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright snapshot fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>10x and 60x UPlan FLN &#8734;/-/FN 26.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright bright field microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 2500M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Ultrawave Ltd.</td>
			<td>U95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34863</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Sildes, Clear, Ground</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(7&#8211;8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>VDT-731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT7900.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>479527</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(25&#8211;35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>HMS-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat 100 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BALI828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KS230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ST10-031T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Carbon Tape</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGG3939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-Mercaptohexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448303-1G</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>643203</td>
			<td>Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529303</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84415</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675105</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) nitrate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203106</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/0840/53</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>&#34;Detergent&#34; in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10253041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10790113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cantilever</td>
			<td>BudgetSensor</td>
			<td>ContAl-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies

Skanning sonde mikroskopi har aktivert etableringen av en rekke metoder til konstruktiv ('additiv') topp-ned fabrikasjon av nanometer-funksjonen. Historisk, har en stor ulempe skanning sonde litografi vært det egentlig lav overføringshastighet enkelt sonde systemer. Dette har blitt håndtert ved bruk av matriser med flere sonder aktivere økt nanolithography gjennomstrømning. For å implementere slike parallelized nanolithography, nøyaktig justering av sonden matriser med substrat overflate er viktig, slik at alle sonder kontakt med overflaten samtidig når litografisk mønstre begynner. Denne protokollen beskriver bruken av polymer penn litografi å produsere nanometer-funksjonen over centimeter store områder, tilrettelagt av bruk av en algoritme for rask, nøyaktig og automatisk justering av sonden matriser. Her viser nanolithography av thiols på gull underlag generering av funksjoner med høy ensartethet. Disse mønstrene er så functionalized med fibronectin for bruk i forbindelse med overflaten-rettet cellen morfologi studier.

For å sjekke om den automatiske justeringen hadde vært vellykket, ble grafene plottet fra justering data (i regnearket fra trinn 4.8) undersøkt. Hvor justeringen prosessen hadde vært vellykket to tomter, tilsvarende vinkelen som eksempel scenen har blitt vippet langs θ og φ akser, viste en rekke stigende og synkende datapunkt. I hver av tomter, to lineær passer datapunktene viste en veldefinert skjærer "peak" Angir maksimal z-utvidelse og den tilsvarende vinkelen som justeringen ble oppnådd (figur 4A og 4B). Denne prosessen er gjentatt fire ganger (dvs., to ganger for hver akse) og plottet som et sett med fire koordinater. Skjæringspunktet mellom hvert par av koordinater dermed viser samlet optimal vinkler (figur 4C). 13 i tilfeller der justeringen ikke var vellykket, det kan observeres at deres tilsvarende θ og φ vinkel tomter gir ikke god lineær passer, eller overlapper ikke (figur 5). Slike mislykkede justeringer er vanligvis som følge av matriser blir feil trimmet eller montert til sonde abonnenten (trinn 1.7, 1,8 og 2.2). I disse tilfellene arrayene ble forkastet en ny forberedt og montert (trinn 1 og 2) og justeringen prosessen gjentas (trinn 4).
Vellykket justering og Litografi med MHA av PPL, ble mønstret gull underlag deretter fotografert med kraft mikroskopi for å undersøke om avsettelse hadde funnet sted. En større området undersøkelse av utskrevet flatene ble også utført av optisk mikroskopi av underlagene etter etsing av gull ikke beskyttet av avsatt thiol (figur 6 og figur 7). Imidlertid etset mønstre kan ikke brukes for videre functionalization og bør bare brukes til å bekrefte mønstre på representative utvalg av en gruppe med trykte overflaten underlag. Hvis etset mønstre viser tomme områder tilsvarer personlige penner (Figur 8), angir dette resultatet at produksjonen av sonden matriser ikke er gjort med hell, og at noen sonder er skadet eller mangler. Denne inhomogeneity av sonder kan skyldes bruk av en gammel master hvor det perfluorinated belegget har slitt bort (trinn 1.3), som resulterer i noen sonder revet bort når matrisen er atskilt fra master. I disse tilfellene, skal en ny mal brukes. Resultatet kan også skyldes tilstedeværelse av luft bobler fanget mellom glasset oppbakking og master (trinn 1.5), eller hvis sonde matrisen ikke var rent atskilt fra master etter (trinn 1.8).
Fluorescerende mikroskopi bilder av fibronectin functionalized overflater inkubert hMSCs var også samlet (figur 9). Generelt alle underlag var stabile i i vitro kultur miljøet og cellene overholdt og tilpasset deres morfologi mønstrene i mindre isolert 20 x 20 utvalg av funksjoner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Figur 1. Skjematisk fremstilling av polymer penn litografi viser molekylær blekk transport via en vann menisk på probespissen. (A) siden og (B) ovenfra polymer penn matrisen angir at når sonde matrise og overflate underlaget er fullt justert, alle sonder kommer i kontakt med overflaten samtidig, noe som resulterer i parallelized litografi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Figur 2. Skjematisk diagram av polymer penn litografi satt opp (A) utvidet sidevisning av eksperimentelle satt opp hvor forberedt sonde matrisen er festet for å undersøke holderen og montert til AFM skanner. Underlaget er plassert på scenen, under som ligger tre tvinge sensorer. (B) en representasjon av sammensatte instrumentering, viser AFM Skannerhodet i forhold til prøven scenen. (C) nedenfra viser force sensor plasseringen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Figur 3. Skjematisk fremstilling viser programmet spektroskopi fremgangsmåten for justering. AFM skanneren er satt til flytte sonder mot prøven ved en avstand på 10 µm innen 100 ms, holdt i posisjon for 250 ms, etterfulgt av en tilbakekalling av 10 µm innen 100 ms, og deretter holdt i 250 ms trukket inn der. Bevegelse gjentas deretter gjennom justeringen prosessen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Figur 4. Diagrammer illustrerer en vellykket justering. Grafer av z posisjon mot tilt vinkler (A) θ og (B) φ for en vellykket justering, der ● angir de faktiske verdiene målt og + angir best passer med minste-kvadraters-metode. (C) graf φ mot θ utstyrt vinkler med fire poeng der maksimal z-posisjonen ble nådd. Krysningspunktet merket er den siste optimal vinkelen over begge aksene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Figur 5. Diagrammer illustrerer en mislykket justering. Grafer av z posisjon mot tilt vinkler (A) θ og (B) φ for en mislykket justering, der ● angir de faktiske verdiene målt og + angir best passer med minste-kvadraters-metode. (C) graf φ mot θ utstyrt vinkler med fire poeng der maksimal z-posisjonen ble nådd. Ingen klart optima eller skjæringspunkt er observert og derfor optimal justering vinkler ikke løses. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Figur 6. Illustrerende optisk mikroskopi og atomic force mikroskopi bilder av gull underlag som ble mønstret med MHA av justert PPL arrayene og deretter etset. (A) og (B) er sekvensielt forstørret optisk mikroskopi bilder etset mønstre; (C) er et AFM topografi bilde av et enkelt rutenett av mønstre. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Figur 7. Illustrerende optisk mikroskopi bilder av gull underlag som ble mønstret med MHA av justert PPL arrayene og deretter etset. (A) og (B) er sekvensielt forstørret optisk mikroskopi bilder av etset mønstre og (C) er en lavere forstørrelse bilde som viser stort område homogen oppskrifter. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Figur 8. Illustrerende optisk mikroskopi bildet av en gull substrat som var ujevnt mønstret med MHA og deretter etset. Den tiltenkte mønsteret (vises i innfelt) var gjenta rutenett 20 dot linjer ordnet i 20 linjer, med hver to linjer produsert ved å øke z-aksen utvidelse med 1 µm (alt fra 5 til-5 µm). Det kan sees at i enkelte områder ikke mønstre genereres, på grunn av manglende sonder på disse stedene. I områder hvor bare to linjene med prikker er produsert, dette resultatet indikerer at en sonde finnes, men det er ikke av samme høyde som fullt fungerende sonder, så bare innskudd har når matrisen er utvidet til full z-aksen avstand. I dette bildet har kontrasten vært bevisst endres for å aktivere observasjon av delvis utskrevne områder. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Figur 9. Epifluorescence mikroskopi bilder av hMSCs kultivert på fibronectin arrayene mal av PPL. (A) og (B) er høy forstørrelse bilder viser individuelle celler. (C) viser et eksempel mønster av fibronectin array uten en tilhenger cellen og (D) er et bredt felt av cellene kultivert i et rutenett (en skjematisk av det utskrevne mønsteret blir også vist på i innlegget). Cellene er farget for å vise fibronectin (rød), F-utgangen (grønn) og celle kjerner (blå). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies at JoVE.com

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Her presenterer vi en protokoll for regionnett skanning sonde nanolithography aktiveres av iterativ justeringen av sonden matriser, samt bruken av litografiske mønstre for celle-overflate samhandling studier.

Stor-området skanning sonde Nanolithography tilrettelagt av automatiserte justering og dens anvendelse til underlaget fabrikasjon for cellen kulturstudier

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Mikropipette Aspirasjon av substrat-tilkoblede celler å anslå Cell Stivhet

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock Wave Søknad til cellekulturer

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikrofluid Technique å sondere Cell Fleksibilitet

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tredimensjonal Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funksjonell prekliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymer Microneedle Array Fabrikasjon av Fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikasjon av ekstracellulære matrise-avledet Skum og Mikrocarriers som Tissue-spesifikke cellekultur og Delivery plattformer

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisert lysbildet skanning og segmentering i Fluorescently-merket vev bruker Widefield høyt innhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetode for å opprettholde quiescent humane hematopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Fabrikasjon av en krystallinsk nanocellulose innebygd agarose biomateriale blekk for benmarg-avledet mastcellekultur

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...