Name: large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies at JoVE.com

Авторы признают финансовой поддержки из различных источников, включая инженерные Великобритании и физическим научным исследованиям Совета (Грант РЭС. EP/K011685/1, EP/K024485/1) и выпускник студенчества для JH; Леверхульме доверия (РПГ-2014-292); Фонд институционального стратегической поддержки Уэллком траст (105610/Z/14/Z); Британский Совет (216196834); и в университете Манчестера в университете Манчестера научно-исследовательский институт (умри насос грунтование фонд) и президентской докторской стипендии для SW. технической помощи д-р Андреас Lieb (Nanosurf AG) также благодарностью.

<ol>
	<li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Strategies+in+Nanolithography.">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).</li><li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Approaches+to+Nanofabrication:+Molding,+Printing,+and+Other+Techniques.">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li><li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Scanning+Probe+Lithography.">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li><li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-Pen"+Nanolithography.">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography.">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fountain+Pen+Nanochemistry:+Atomic+Force+Control+of+Chrome+Etching.">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li><li>Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution.">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li><li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid:+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles.">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li><li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays.">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li><li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Pen+Lithography.">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li><li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hard-Tip,+Soft-Spring+Lithography.">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Force-Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography.">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li><li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Scanning+Probe+Nanolithography+Facilitated+by+Automated+Alignment+of+Probe+Arrays.">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li><li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multipoint+Force+Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography.">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li><li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder.">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li><li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-Bioelectronics+via+Dip-Pen+Nanolithography.">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li><li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate.">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li><li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography.">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices.">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography.">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li><li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+"Dip+Pen+Nanolithography".">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Metal+Nanowires+Using+Microcontact+Printing.">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li><li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates.">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li><li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour:+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine.">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).</li><li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography.">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li><li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins.">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li><li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography.">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li></ol>

Выравнивание алгоритм и программное обеспечение были разработаны и являются собственностью, Манчестерский университет. Он доступен для загрузки на http://www.click2go.umip.com/.

Этот протокол служит для предоставления пользователям с удобным методологии быстро осуществлять nanolithographic, кучность с высокая однородность и размер управляемой функции над большой (см2) областях. Субстраты, принимая эти большие площади nanopatterns может быть далее разработан для различных приложений. Один из основных применение этой технологии в поколения nanofabricated поверхностей для исследования взаимодействия клетк поверхности. Этот отчет показывает некоторые наглядные примеры клеточной культуры на эти материалы, демонстрируя контроля МСК морфологии, nanofabricated субстратов.
Ключевым фактором настоящего Протокола является автоматизация процедуры выравнивания (шаг 4) который позволяет единообразного и высок объём производства функций на поверхностях, вплоть до наноразмерных резолюции, которая позволяет быстрый оборот культуры клеток экспериментов. Литография пером полимера, осуществляется с помощью этого алгоритма выравнивания способен генерировать наноразмерных компонентов в течение примерно 30 мин. Воспроизводимость и точность автоматического выравнивания и таким образом единообразия узорной функций, — однако критически зависит качество зонд массивов, которые производятся (шаг 1 и 2). Любые недостатки в их подготовке, которые приводят к тупым, сломаны или отсутствуют датчики; таких захваченных воздушных пузырьков (шаг 1.5) или неправильное разделение зондов от хозяина (шаг 1.8) может привести к неточной выравнивание и низкого качества литографии.
Это сообщили, что метод разделяет ограничение общего другие методы выравнивания, которые полагаются на силовой обратной связи. Точное определение когда зонды находятся в контакте с поверхностью ограничивается необходимостью учитывать фон вибрации, вызванные окружающей среды и движение на стадии образца. В общем датчики имеют чувствительность силы в µN режиме (2 µN в данном случае), но выравнивание алгоритм предназначен только зарегистрировать силой по крайней мере 490 µN как окончательный контакт между штырями и поверхностью, для того чтобы избежать любых resul «ложных срабатываний» Тин от фонового шума. 13 таким образом, этот метод имеет тенденцию производить большие возможности (1-2 мкм) поскольку датчики должны продлен большое расстояние на z-оси (с последующим высшие силы) для того чтобы зарегистрировать контакта. Для того, чтобы компенсировать, меньше функций могут быть получены путем сокращения z-оси пробег на этапе литография (например, введя параметр «Черный» на шаге 5.2.3.2 как 3 мкм вместо 5 мкм).
Тем не менее, даже при этом ограничение, Автоматизация алгоритмов способна решить важнейший аспект в применении методов параллельного сканирования зонд литографии, как выравнивание было ранее наиболее требовательных и неточные шаг по времени в Реализация этих методов. Эта автоматизация теперь переносит ограничения скорости шаг процесса изготовления из выравнивание литографических писать сам. Хотя этот протокол демонстрирует применение этой процедуры выравнивания для PPL, рамки может применяться к ряду SPL методы, такие как липид DPN26 и при содействии матрицы литографии27 , а также потенциального будущего каталитического зонд систем. 28

Прогресс в области нанотехнологий зависит от разработки методов, способных эффективно и надежно изготовления наноразмерных компонентов на поверхностях. 1 , 2 однако, создавая такие особенности на больших площадях (несколько см2) надежно и на относительно низкая стоимость нетривиальных усилий. Большинство существующих методов, производный от полупроводниковой промышленности, полагаются на абляционного фотолитографии для изготовления «твердый» материалов. Совсем недавно литографический методы, производные от сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) появились как удобный и универсальный подход для быстрого прототипирования наноразмерных конструкций. 3 методы, основанные на РП возможность удобно и быстро «писать» любой шаблон, определяемые пользователем. Наиболее известным из них является dip Пен нанолитографию (ДПН), впервые Миркин et al.,4 где сканирующего зонда используется как «перо» для передачи молекулярной «чернила» на поверхности особенности в моде, аналогичные письма. При температуре окружающей среды, как зонд проверяется по всей поверхности молекулы «чернила» передаются поверхности через воды мениска, который формирует между зондом и поверхностью (рис. 1). DPN таким образом позволяет nanolithographic осаждения широкий спектр материалов, в том числе «мягкие» таких полимеров и биомолекул. 5 Родственные методы, с помощью зондов, инженерии с каналами для доставки жидкости, различно называется «nanopipettes» и «nano-авторучки», также поступало. 6 , 7 , 8
Главным препятствием для более широкого применения СПР производные литографии является пропускная способность, как это требует слишком много времени в шаблон сантиметр масштаба районы с единичного пробоотборника. Ранние усилия для решения этой проблемы сосредоточены на распараллеливания основанных на консольные ДПН, с «одно-мерного» и «двумерные» (2D) зонд массивы, сообщанными для литографии сантиметр размера областей. 5 , 9 однако эти массивы консольные производятся через сравнительно сложный многоэтапный изготовление методы и относительно слабы. Изобретение полимера перо литография (PPL) рассматривала этот вопрос путем замены стандартных кантилеверов СЗМ с массивом 2D мягкой силоксановых эластомер зондов, приклеенная к слайду стекла. 10 этот простой датчик установки значительно снижает стоимость и сложность структурирования больших площадей, открытие кантилеверных для более широкого круга приложений. Эта консольно бесплатные архитектура также была расширена жесткий отзыв пружину литографии,11 , которая обеспечивает гибрид мягких эластичных минусовки с жесткий кремния советы, давая более резолюции по сравнению с шаблонов производится с помощью мягкой эластомер советы.
Решающим фактором в реализации этих технологий двумерный массив является, что зонд массив должен быть точно параллельна поверхности субстрата так, что когда литографии используется, все датчики соприкасаться с поверхностью одновременно. Даже небольшой перекос может привести к большой разницы в размере функция с одной стороны массива на другой, так как некоторые датчики будут контактировать поверхность ранее во время спуска массива, в то время как другие вступит в контакт позже или не на всех. 12 точное выравнивание особенно важна с PPL благодаря деформируемость мягкая эластичная зондов, где будут сжаты зонды, связавшись с поверхности ранее, оставляя больше след на поверхности.
Ранние работы на PPL работают чисто визуальный осмотр направлять процесс выравнивания, с помощью камеры, установленной выше массив наблюдать деформации пирамидальной зондов, как они были принесены контакт с поверхностью. 10 выравнивание судил наблюдения, какой стороне зондов соприкоснулся с поверхности сначала, то Регулировка угла и повторяя процедуру на постоянной основе до тех пор, пока разница в контакт на каждой стороне зонда неразличимы глазом. Поскольку эта процедура выравнивания зависит от субъективных визуальный осмотр оператором, воспроизводимость является низким.
Впоследствии был разработан более объективный подход, состоящий из сил Датчик монтируется под субстрат для измерения силы, применяется при контакте зондов на поверхности. 12 выравнивание таким образом было достигнуто путем регулировки углов наклона максимизировать сила, которые сообщили, что все датчики одновременно в контакте. Этот метод показал, что выравнивание для 0,004 ° параллельно поверхности возможно. Это «сила обратной связи выравнивание» теперь реализована в полностью автоматизированных систем в двух независимых докладах. 13 , 14 как использовать триады датчиков силы монтируется под субстрат или выше массив и измерить количество силы оказываемого на контакт между массивами зонда и поверхностью. Эти системы дают высокой точности, отчетности некоаксиальности ≤0.001 ° на 1 см Длина шкалы,14 или ≤ 0,0003 ° над 1.4 см.13 эти автоматизированные выравнивание системы также обеспечивают крупные сбережения в времени оператора и общее время, требуемое для завершения литография процесса.
Один из основных применение высок объём поверхности этой технологии изготовления это поколение субстратов культуры клеток. Сейчас хорошо известно, что фенотип ячейки можно манипулировать, контролируя первоначального взаимодействия между клетками и особенности поверхности, и что это может быть повышена на наноуровне. 15 специально, зонд литографии методы как доказано быть поверхностным методом для производства различных поверхностей nanofabricated для таких экспериментов культуры клеток. 16 например, поверхности, представляя наноразмерных структур собственн-собранные монослои и внеклеточного матрикса, белки шаблонного PPL и DPN были использованы для изучения потенциала нано модифицированных материалов в материале индуцированной дифференциация Стволовые клетки. 17
Этот протокол описывает использование модифицированных атомно-силового микроскопа (AFM) системы, которая позволяет большой площади PPL. Мы подробно определение силы, используя множественные датчики силы в качестве средства определения зонд поверхности контакта, используя алгоритм, который автоматизирует процесс последовательной выравнивания. Последующие функционализации этих шаблонов с фибронектин белков внеклеточного матрикса и культуры мезенхимальных стволовых клеток (МСК) описаны, как проявление PPL-готовых поверхностей, применяется для клеточной культуры.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZ&#920;&#934;) translation and goniometer stage</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>P40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM control software</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>C3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z225568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaFlo</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-FMG-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Dry Oxygen Service Pump</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-OPE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ015WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Humidity Generator</td>
			<td>proUmid</td>
			<td>MHG32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline Plus Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon masters</td>
			<td>NIL Technology</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright snapshot fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>10x and 60x UPlan FLN &#8734;/-/FN 26.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright bright field microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 2500M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Ultrawave Ltd.</td>
			<td>U95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34863</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Sildes, Clear, Ground</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(7&#8211;8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>VDT-731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT7900.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>479527</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(25&#8211;35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>HMS-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat 100 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BALI828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KS230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ST10-031T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Carbon Tape</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGG3939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-Mercaptohexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448303-1G</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>643203</td>
			<td>Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529303</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84415</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675105</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) nitrate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203106</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/0840/53</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>&#34;Detergent&#34; in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10253041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10790113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cantilever</td>
			<td>BudgetSensor</td>
			<td>ContAl-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies

Сканирующая зондовая микроскопия позволяет создание различных методов для конструктивного изготовления (присадки) сверху вниз нанометровом масштабе функций. Исторически, основным недостатком сканирующего зонда литографии неразрывно низкую пропускную способность систем одного датчика. Это может быть решена путем использования массивов несколько зондов для включения кантилеверных увеличение пропускной способности. Для реализации такого параллельного нанолитографию, точное выравнивание зонд массивов с поверхности субстрата является жизненно важным, таким образом, чтобы сделать все датчики контакта с поверхностью одновременно, когда начинается литографических кучность. Этот протокол описывает использование полимерных перо литографии производить нанометровом масштабе функции над сантиметр размера районов, облегчается использование алгоритма для быстрого, точного и автоматизированных выравнивание зонд массивы. Здесь нанолитографию тиолы на золото субстратов демонстрирует поколения функций с высокой однородности. Эти шаблоны затем функционализированных с фибронектин для использования в контексте исследований по морфологии ориентированные на поверхности клеток.

Чтобы проверить, было ли успешным автоматического выравнивания, были рассмотрены графики построены из выравнивание данных (в таблице из шага 4.8). Там, где процесс выравнивания были успешными двух участков, соответствующий угол, в котором стадии образца была наклонена вдоль осей θ и φ, показали серию растет и по убыванию точек данных. В каждом из участков, два линейных подходит точек данных показал четко пересекаются «пик», показывающее максимальное z-расширение и соответствующий угол, на котором выравнивание было достигнуто (рис. 4A и 4B). Этот процесс является неоднократные четыре раза (т.е., дважды для каждой оси) и как набор четырех координат. Таким образом, пересечением каждой пары координат показывает целом оптимальных углов (рис. 4 c). 13 в тех случаях, когда выравнивание не был успешным, он может наблюдаться что их соответствующих θ и φ угол участки не дают хорошего качества линейные посадки, или не пересекаются (рис. 5). Такой сбой рядов, как правило, в результате массивы неправильно обрезать или монтируется держатель зонда (шаги 1.7, 1.8 и 2.2). В этих случаях массивы были удалены и один новый подготовленный и смонтированы (шаги 1 и 2), и процесс выравнивания повторяется (шаг 4).
После успешного согласования и литографии с МГА закона о госзакупках рисунком золото субстратов были затем образы с помощью микроскопии боковое усилие для изучения ли осаждения имели место. Большие области экспертизы печатной поверхности вел оптической микроскопии субстратов после травления золота, не защищены на хранение тиоловых (Рисунок 6 и рис. 7). Однако травлению шаблоны не могут использоваться для дальнейшего функционализации и должен использоваться только для подтверждения кучность на репрезентативных выборок партии печатной поверхности субстратов. Если травлению шаблоны пустых областей, соответствующих отдельным ручки (рис. 8), этот результат указывает, что производство зонд массивов не было успешно сделано, и что некоторые зонды повреждены или отсутствуют. Эта неоднородность зондов может быть за счет использования старых мастеров, где покрытие перфторированные стерлась (шаг 1.3), что привело в некоторых пробах раздирают прочь когда массив отделена от мастера. В этих случаях следует использовать новый мастер. Результат может также объясняться присутствие воздушных пузырьков в ловушке между стеклом бэк и мастер (шаг 1.5), или если массив зонд был не разделить от мастера после отверждения (шаг 1,8).
Флуоресцентными микроскопии изображения поверхностей фибронектин функционализированных инкубирован использования были также собраны (рис. 9). В общем все субстраты были стабильными в среде культуры в пробирке и клетки придерживался и адаптировать их морфология напечатанные картины в случае небольших изолированных 20 x 20 массив функций.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление полимера перо литографии показаны молекулярной чернила транспорта через воды мениска на кончике зонда. (A) вид сбоку и (B) сверху массива перо полимер указывают, что когда зонд массив и поверхности субстрата полностью выровнены, все датчики контактируют поверхность одновременно, результате распараллеленное литографии. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Рисунок 2. Принципиальная схема литография пером полимера установить вверх (A) расширение сбоку экспериментальной установки где подготовленные зонд массив прилагается держатель зонда и монтируется на AFM сканера. Субстрат помещается на сцене, ниже которой расположены три силы датчики. (B) представление собранных приборостроение, показаны AFM сканирования головы по отношению к стадии образца. (C) снизу вид расположения датчика силы. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Рисунок 3. Схематическое изображение изображением спектроскопии программа для процедуры выравнивания. AFM сканер установлен для перемещения преобразователей сторону образца на расстоянии 10 мкм в пределах 100 мс, состоявшейся в позиции для 250 мс, следуют Ретракция 10 мкм в течение 100 мс, а затем провела для 250 мс в задвинутом положении. Затем движение повторяется на протяжении всего процесса выравнивания. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Рисунок 4. Графики, иллюстрирующие успешные выравнивание. Графики позиции z против углы наклона (A) θ и (B) φ для успешного выравнивания, где ● указывает фактические значения измеренных и + указывает лучший подходят с помощью метода наименьших квадратов. (C) граф φ против θ установлены углы с четырьмя точками, где была достигнута максимальная z позиции. Точка пересечения отмечены является окончательной оптимальный наклон по обеим осям. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Рисунок 5. Графики, иллюстрирующие неудачной выравнивание. Графики позиции z против углы наклона (A) θ и (B) φ для неудачного выравнивания, где ● указывает фактические значения измеренных и + указывает лучший подходят с помощью метода наименьших квадратов. (C) граф φ против θ установлены углы с четырьмя точками, где была достигнута максимальная z позиции. Нет четких Оптима или точка пересечения наблюдаются и поэтому оптимальное выравнивание углов не разрешаются. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Рисунок 6. Иллюстративный оптической микроскопии и атомно-силовой микроскопии изображений золото субстратов, которые были узорной с МГА в соответствие закона о Госзакупках массивы и затем травлению. (A) и (B) последовательно увеличенное оптической микроскопии образы травлению шаблонов; (C) это изображение топографии AFM одной сетки шаблонов. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Рисунок 7. Иллюстративный оптической микроскопии изображений золото субстратов, которые были узорной с МГА в соответствие закона о Госзакупках массивы и затем травлению. (A) и (B) являются последовательно увеличенное оптической микроскопии изображений травлению шаблонов и (C) ниже увеличение изображение, которое показывает большой площади однородной структуры. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Рисунок 8. Иллюстративный оптической микроскопии образ золотых субстрата, неравномерно с МГА узором и затем травленная. Предполагаемой структуры (см. вставку) повторяющиеся сеток 20 точечных линий, расположенных в 20 линиями, с каждые две линии производства путем увеличения z-оси расширение 1 мкм (от 5 до-5 мкм). Можно увидеть, что в некоторых областях не шаблоны создаются из-за отсутствующих зонды в этих местах. В районах, где производятся только две линии точек, этот результат означает, что зонд присутствует, но это не такой же высоты как полностью функционирующей зонды, поэтому только показывает когда массив расширяется до полной z-оси расстояние. На этом изображении контраст был намеренно изменены, чтобы включить наблюдение за частично печатной области. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Рисунок 9. Эпифлуоресцентного микроскопии изображений использования, культивируемых на массивах фибронектин шаблонного закона о госзакупках. (A) и (B) являются высокое увеличение изображения показаны отдельные клетки. (C) показывает пример шаблона фибронектин массива без сторонник клеток и (D) представляет собой широкое поле изображение клетки культивировали в механизме сетки (схема набивным рисунком также показано в инкрустации). Клетки запятнаны Показать фибронектина (красный), F-актина (зеленый) и мобильных ядер (синий). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies at JoVE.com

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Здесь мы представляем протокол для обширной территории сканирования зонд кантилеверных включена путем итеративного выравнивание зонд массивов, а также использования литографических моделей для исследования взаимодействия клетк поверхности.

Большая площадь сканирования зонд нанолитографию способствовало автоматического выравнивания и его применение для изготовления подложки для изучения культуры клеток

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Микропипетки Стремление основания подключенных клетки к оценке сотовых жесткости

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Ударно-волновой Применение к клеточных культур

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Микрожидкостных Техника для исследования клеток деформируемости

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Универсальный ручной трехмерной оптико-акустической визуализации зонд для Deep Tissue человека ангиографии и функциональных доклинических исследований в режиме реального времени

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Полимерные микроиглы массив Изготовление по фотолитографии

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Метод культуры для поддержания тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Изготовление кристаллических наноцеллюлозных встроенных чернил агарозного биоматериала для культуры тучных клеток, полученных из костного мозга

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...