Name: efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21CA182197 על חיילים), ראלף וו ואמון גרייס מ שוואלטר מחקר, ועל -ידי את פרדו אגרונומיה והסיומת עבור תוכנית לפיתוח כלכלי (AgSEED). סאנגר רצף נתונים נרכשו על ידי המתקן Purdue גנומיקה הליבה תומכת P30 CA023168. מרי Witucki נתמכה על ידי המרכז האוניברסיטאי Purdue עבור סרטן מחקר הקיץ לתואר ראשון תכנית המחקר נתמך על ידי האגודה סרטן במחוז קארול. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים בנימין קרטר, אלן דנינג, טיילור סבתו על מתן משוב ביקורתי כתב היד. אנו מודים למחלקה לביוכימיה לתמיכה של עבודה זו, המרכז לחקר דג זברה באוניברסיטת פורדו בהקדשה שלהם טיפול, רווחה של המושבה דג זברה. לבסוף אנו מודים המתקן הליבה גנומיקה פרדו, תרומות של פיליפ סן מיגל לגבי השירותים המיתרים.

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ג'ין הסתרה במערכת מודל חוליות דג זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. מספר פרוטוקולים תוארו קודם לכן לבצע הנדסה הגנום בתיווך CRISPR דג זברה15,25,26,50,51,52. פרוטוקול זה מתבסס על המאמצים הקודמים על-ידי שילוב של מספר טכניקות ניסיוני פשוטה אך עקבי reproducibly, בפרט HMA, המיתרים של מספר דגים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, כדי ליצור ישירה חסכן, והפרוטוקול השפעול חזקים עבור מוטגנזה מכוונת בתיווך CRISPR ב דג זברה המתאים עבור מעבדות מאויש עם כוח אדם באמצעות מגוון של הכשרה, ניסיון, כמו גם מעבדות.
המלצות על עיצוב, סינתזה של מדריך ש-rnas כלולים פרוטוקול זה. שיקול מרכזי במדריך עיצוב ה-RNA הוא צמצום תופעות מחוץ-יעד. מספר אלגוריתמים חיזוי פותחו כדי לאפשר CRISPR-למשתמשים גישה לכלים חישוב עם ממשקים גרפי ידידותי למשתמש לחזות גם את הפעילות של המדריך על המטרה וגם את הסיכוי של חופש-יעד אפקטים34, 35,36. יתרון מסוים של מערכת דג זברה הוא הוריד שערי תופעות רחוק ממסלול הנחיתה-כי Cas9 מוזרק העוברים ולכן הביטוי ארעי, אשר הוכח בעכברים כתוצאה מכך ירד את המטרה אפקטים53. ובכל זאת, את המטרה אפקטים הוכחו להופיע אצל דג זברה54. דרך אחת כדי לשלוט לאפקטים חופש-יעד היא דג זברה מייסד פנוטיפ, שנוצרו על ידי שני RNAs מדריך עצמאי שמכוון אותו גן, מדריכים אלה יהיה קרוב לוודאי להשפיע על אתרים הנחה-יעד שונים. שיטה חלופית כדי למזער את ההשפעות את המטרה המתואר לא ב פרוטוקול זה הוא השימוש Cas9 מוטציה אשר יוצר מעברי חוט יחיד על המטרה ה-DNA, אשר תוקנו עם יעילות גבוהה. זיווג ניקס דנ א בתוך הקרבה של אחד לשני כי הם משלימים את ההפך קווצות תוצאות במבנה ויאסין יעיל-מיקומה הרצוי, ממזער את המטרה אפקטים55,56.
בנוסף תעריפים שונים של תופעות מחוץ-יעד, sgRNAs שונים יכולים להיות שונים שערי מוטגנזה מכוונת של היעד הרצוי57,58,59. פרוטוקול זה משתמש HMA כדי לנתח את יעילותו של מוטגנזה מכוונת של sgRNA נתון באמצעות heteroduplex הלהקה היווצרות33,40. להקות Heteroduplex נוצרות על ידי הכלאה של גדילי DNA שנוצר על-ידי ה-PCR מכילים אי-התאמות, והוא יכול בקלות לפתור באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. בניגוד לשיטות אחרות בשימוש נפוץ כדי למדוד את היווצרות ויאסין, כגון endonuclease T7 assay או ברזולוציה גבוהה להמיס ניתוח25,26, HMA אינה דורשת אנזים יקר לחתוך DNA שאינם תואמים, ואין צורך ניתוח מורכב של ה-PCR להמיס עקומות. חשוב לציין, שימוש HMA לאימות שיעור גבוה של היווצרות ויאסין באוכלוסייה מוזרק גם מאפשר החוקר לצמצם את מספר הדגים הדרושים לייצור עוקבות של קווים הנוק-אאוט, המפחיתה את העלות לזיהוי מוטציה עם התכונות הרצויות.
הקלות היחסית יצירת מבוססי CRISPR indels מאפשר יצירה של אללים מרובים של גנים מרובים בבת אחת. תוכנה מבוססת אינטרנט זמין עבור ניתוח של מוטציות יחידה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים דגים באמצעות סנגר רצף של מוצרי ה-PCR49. במקרה שבו שלושה או יותר CRISPR-מוטציה אללים מנותחים, המיתרים לאפיין את אופי ויאסין הוא כנראה להיות עלות יותר אפקטיבי כדי לאפיין את אופי ויאסין כמו גישה זו מאפשרת מאגר של עד 50 אללים שונים כדי להיות מאופיין ב o nce61,60,(ראה טבלה של חומרים)62. כלכלת בקנה מידה כזה סביר להניח יהיה שימושי במיוחד באווירה מעבדה לתואר ראשון.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק הנחיות צעד אחר צעד ליצירת reproducibly באיכות גבוהה CRISPR ריאגנטים (ב בפרט, sgRNA) כך פחות דגים למבוגרים צריך להיות שנוצרו וניתח בהצלחה לזהות את אללים mutant הריבית, אשר גם מפחית את זמן ועלות של יצירת הקווים הרצויים. חשוב לציין, פרוטוקול זה תוכנן כך זה יכול להיות מיושם על ידי מעבדות עם משאבים מוגבלים כדי לייצר דג זברה מוטנטים באופן סביר. יתר על כן, מצאנו כי גישה זו מתאימה לתלמידי, ובכך מרחיב את ההזדמנויות עבור חינוך והכשרה של סטודנטים לתואר ראשון המעוניינים התנסות בעריכת הגנום מבוסס CRISPR.

שימור מכונות מולקולריות על פני פרוקריוטים ביסוד בכוח באמצעות מודל אורגניזמים למחקר. רבות ממערכות אלה דגם להקל על השימוש של גישות הפוכה-גנטית כמו ג'ין יישוב הסתרה כדי לאפיין את התרומה של מוצר ג'ין לתהליך ביולוגי או מחלה של ריבית. טכניקות שיבוש גנטי אורגניזמים כגון דג זברה יש היסטורית הסתמך על יישוב מבוא של מוטציות frameshift הנובעים תיקון מדויק של DSBs1,2. כאשר DSB מוחדרים הגנום, הנגע DNA יתוקן בזו של שני המסלולים הקיימים אוניברסלית כמעט כל סוגי תאים ואורגניזמים: קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR)3,4 . הטבע מדויק של מכונות NHEJ מייצרת לעתים קרובות indels השונים אורכים5,6,7,8,9. הקדמה של frameshift מוטציות ברצף קידוד של גנים יכול לייצר codon עצירה מוקדמת, אשר לעתים קרובות הופך את הגן מתפקד.
מוקדם אסטרטגיות הנדסיות הגנום דג זברה כדי לקדם את indels כולל meganucleases nucleases אבץ-אצבע, תמלול אפקטור activator דמוי nucleases, אשר מנוצל אינטראקציות חלבון-דנ א למטרה של נוקלאז מסוים גנומית היעד שבו הוא הציג DSB10,11,12,13,14,15. עם זאת, טכנולוגיות אלה לעיתים קרובות קשה להחיל עקב ההנדסה מייגעת ומורכבת הדרושים כדי ליצור נוקלאז שמכוונת את רצף ה-DNA של עניין. בניגוד אסטרטגיות הקודם, ג'ין מבוססי CRISPR עריכה לא להסתמך על אינטראקציות חלבון-DNA עבור מיקוד. במקום זאת, endonuclease הקשורים CRISPR (Ca) מכוונת דרך מדריך RNA המשתמשת נוקלאוטיד הבסיס זיווג אינטראקציות למטרה אתר גנומית של ריבית16,17,18,19 20, ,21. בגלל הפשטות של עיצוב של RNA מדריך עם הבסיס הרצוי זיווג אינטראקציות הכוונת זה קל יחסית למקד את endonuclease Cas על מיקומה הרצוי. הסוג השני CRISPR מערכת בפרט נרחב פותחה עבור יישומים לעריכת הגנום עקב מספר תכונות יתרון כולל שימוש יחיד וחשבונות קס נוקלאז (Cas9) שדורש אינטראקציה עם ה-DNA כדי לעורר פעילות endonuclease שימוש RNA מדריך יחיד (sgRNA) כדי להגדירה על רצף ה-DNA cognate18. הדרישות רצף הכרחי עבור פילוח של sgRNA cognate ובכן מובן19, sgRNA הרצוי נוצר בקלות על ידי שעתוק במבחנה . הפשטות ואת החוסן של הגישה CRISPR/Cas9 מאוד מקל שינוי גנטי יישוב בדג זברה ועוד מגוון רחב של אורגניזמים אחרים.
היכולת המשופרת מתחייב הגנום יישוב עריכה בדג זברה בעקבות פיתוח ריאגנטים מבוססי CRISPR יש באופן משמעותי גדל הזדמנות ללמוד תהליכים הסמלי של אורגניזמים חוליות כגון התפתחות המרכזי עצבני מערכת. הגנום דג זברה מכיל orthologs של 70% של גנים חלבונים הנמצאים את הגנום האנושי, כמו גם 84% של גנים הקשורים במחלות בני22. דג זברה פיתוח מוצגים מספר האיכויות מפתח המשפרים את השימוש בו מחקרים גנטיים הפוכה: העוברים הונחו ב וזעקה גדולה, לפתח חיצוני מהאם הפיכתם מניפולציה נוטה גנטי על ידי microinjection, דג זברה למבוגרים בוגרת מינית על ידי 3 חודשים של גיל, המאפשר התפשטות מהירה של השורות הרצוי23.
פרוטוקולים רבים זמינים המתארים את מגוון של גישות להפיק ולזהות נגזר CRISPR indels דג זברה24,25,26,27,28,29 30, ,31. עם זאת, רבים של הליכים אלה הן זמן אינטנסיבי, דורשים גישה לציוד יקר, עשויה להיות מאתגרת עבור מעבדות עם מומחיות מוגבלת. השלבים המתוארים בזאת מספקים פשוט, עמיד וחסכוני CRISPR/Cas9-אסטרטגיה לקווים נוקאאוט של מהנדס דג זברה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ערכה יעילה במיוחד לסנתז sgRNAs באמצעות DNA oligonucleotides (oligos), בדומה גישות אחרות שהיו בעבר תיאר32. הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים בפרט במידה רבה לפשט ניתוח של מוטציה CRISPR קווים: השימוש HMA מבוססי ה-PCR33 בקלות לקבוע הנוכחות של הגנום שינויים, וניתוח רצף של צעד אחר צעד דג זברה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים במהירות ובקלות לקבוע את אופי indels מרובות בצורה חסכונית. בנוסף, הוראות שלב אחר שלב כלולים עבור ובחירת חזקים, יצור אמינים, הזרקה של מדריך RNAs. השלבים שסופק כאן להדגים פרוטוקול חזקות, זולה יחסית המאפשרת עובדי מעבדה עם מגוון של התמחויות לתרום לזיהוי של ג'ין הסתרה של דג זברה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CRISPOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breaking-Cas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChopChop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free technique</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free ethanol</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Cas9 protein with nuclear localization signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target specific oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen sgRNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E3322</td>
			<td>In vitro transccribe guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td>RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Load Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>Loading DNA for electropheresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof, nuclease-free)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For synthesis and purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10328011</td>
			<td>Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0467S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 1 kb</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0552S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0364S</td>
			<td>Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Polyacrylamide (19:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0154</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-100G</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td>Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Visualization of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S7563</td>
			<td>Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>RNA clean up, PCR purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21105</td>
			<td>For amplification of DNA using PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>PCR amplification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo media</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td>Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB0875711Z</td>
			<td>Store embryos, cast injection plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CA3510-8</td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To create wells to hold embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290&#160;</td>
			<td>Dye for visualization of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>To calibrate needle injection volume.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Moving embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Cutting injection needle, tail clipping adult fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Maintaining embryos at 28.5 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td>Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Geneate needles for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Load solution into injection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 820</td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Polyacylamide (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td>Heteroduplex gel casting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>To expell liquid from the capillary for embryo injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Sequencing platform: Wideseq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio

אפיון באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר, palindromic חוזר (CRISPR) מערכת של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת אפשרה פיתוח פלטפורמה להתאמה אישית כדי ליצור במהירות שינויים ג'ין במגוון רחב של אורגניזמים, כולל דג זברה. הגנום מבוססי CRISPR עריכת משתמש מדריך בודד RNA (sgRNA). המטרה של endonuclease הקשורים CRISPR (Ca) ליעד דנ א (gDNA) גנומית של עניין, איפה endonuclease Cas יוצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB). תיקון של DSBs על ידי מנגנוני לשגיאות להוביל הוספות או מחיקות (indels). זה יכול לגרום מוטציות frameshift לעתים קרובות להציג codon עצירה מוקדמת בתוך הרצף קידוד, ובכך ליצור אלל חלבון-null. הגנום מבוססי CRISPR דורשת רק כמה רכיבים מולקולרית והנדסה בקלות מוחדרים העוברים דג זברה על-ידי microinjection. פרוטוקול זה מתאר שיטות השתמשו כדי ליצור CRISPR ריאגנטים עבור דג זברה microinjection וכדי לזהות דגים מפגין germline שידור של גנים CRISPR-השתנה. שיטות אלה כוללות חוץ גופית בתוך שעתוק של sgRNAs, microinjection של CRISPR ריאגנטים, זיהוי של indels המושרה באתר היעד באמצעות שיטה מבוססת-PCR הנקראת heteroduplex ניידות assay (HMA), וכן אפיון indels שימוש של תפוקה נמוכה והן של עוצמה הדור הבא רצפי (הגדרות)-לפי הגישה ניתן לנתח מספר מוצרים PCR שנאסף דגים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים. פרוטוקול זה הוא יעיל יותר כדי למזער את מספר הדגים הנדרשים והן את סוגי הציוד הדרוש כדי לבצע את הניתוח. יתר על כן, פרוטוקול זה תוכנן להיות מקובל לשימוש על-ידי מעבדה האישי של כל רמות ניסיון כולל סטודנטים, הפעלת כלי רב עוצמה כלכלית להיות מועסק על ידי קבוצת מחקר כלשהו מעוניין בביצוע מבוסס-CRISPR שינוי גנטי בדג זברה.

גישות ניסיוניות שמתואר פרוטוקול זה מאפשר ייצור יעיל, חסכוני של דג זברה מעלף קווי בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. התוצאות הבאות נכללו במאמר זה כדי להקל על פרשנות ופתרון של התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה. בעקבות הפקה מוצלחת microinjection של CRISPR-ריאגנטים, ניתן לנתח את העוברים דג זברה פנוטיפים עבירה ועל היווצרות ויאסין באמצעות HMA. פקד מועיל להמחיש את ההצלחה של הניסוי CRISPR הוא השימוש sgRNA שמתואר בשלב 1.5 למקד את הגן לייצור פיגמנטים tyrosinase. היווצרות ויאסין הנוצרות על-ידי Cas9- tyrosinase גורמת לאובדן של פיגמנטציה, הוא הבקיע בקלות על ידי 48 hpf (איור 1). פקד מועיל אחר כדי לוודא את הכנת CRISPR ריאגנטים עבור הזרקה הוכתרה בהצלחה, רק כדי לאשר את באורך מלא (120 nt) sgRNA יש כבר מסונתז באמצעות ג'ל לזיהוי denaturing (איור 2, ליין 1 ו- 2). אם כבר פחתה את הרנ א זה עשוי להיראות כמו כתם, לדוגמה 3 ליין (איור 2) מראה RNA מפורק לא מתאים הזרקת.
כדי לנתח את תדירות היווצרות ויאסין של גנים ממוקד על ידי CRISPR-Cas9 אשר התוצאה אינה עבירה פנוטיפים כגון tyrosinase, ניתוח HMA היא שיטה פשוטה ואמינה. sgRNA/Cas9 מוזרק עוברי נותחה באמצעות תוצאות HMA היווצרות של להקות heteroduplex ולאחר הפחתת עוצמת של הלהקה homoduplex (איור 4). הנוכחות של heteroduplex להקות נוספות מנוצל ב פרוטוקול זה כדי לזהות פוטנציאל דגים מייסד מן העוברים microinjected ובתור מבוגרים (איור 4 , איור 5), כדי לנתח את יעילות העברת germline מייסד ( איור 6), וכדי לוודא הימצאות ויאסין בדג משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים F1 (איור 7). הדג משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים המכילים ויאסין הם מועמדים המיתרים כדי לזהות את אופי ויאסין וכדי לקבוע אם codon עצירה מוקדמת קיים באזור קידוד של הגן היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> איור 1 : דג זברה עוברי התערוכה פגם פיגמנט כאשר הזריקו sgRNA מיקוד tyrosinase בשלב אחד-תא. (א) פראי-סוג, uninjected העובר ב 48 hpf ו- (B) מוזרק העובר ב 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> איור 2 : במבחנה שעתוק של sgRNA באמצעות ערכת סינתזה. Oligos היו מסונתז באמצעות במבחנה שעתוק לפי ההוראות ערכת סינתזה sgRNA. 500 ננוגרם של RNA היה לרוץ על ג'ל שתנן/עמוד כמתואר. sgRNA טעון מסלולים 1 ו- 2 מראה להקה התואם באורך מלא, RNA nt 120 ללא פגע. SgRNA בנתיב 3 מציג מדגם ה-RNA מפורק לא מתאים הזרקת.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> איור 3 : השוואה של הבריאות של עוברי hpf מוזרק 24. העובר החי (A) שפותחה כדי 24 hpf, בקלות נבדל העובר זה יש בוטלה פיתוח (B). עוברי דומים (B) או באופן דרסטי לשנות תכונות (a), כגון עקמומיות בעמוד השדרה או שינו את הראש, התפתחות העין יש להסיר מן המנה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> איור 4 : Heteroduplex assay ניידות של sgRNA-Cas9 microinjected דג זברה עוברי. בריכות של עוברי 5 עבור דגימה שנאספו-72 hpf ו gDNA נעקר. Heteroduplex ניתוח בוצע כמתואר, הדגימות היו מפוצצות באופן שווה 500 ננוגרם של ה-DNA. נתיבים: M = סמן bp 100; 1 = שליטה uninjected; 2 = הזרקה מדגם 1; 3 = הזרקה מדגם 2. צפוי במידה = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> איור 5 : Heteroduplex assay ניידות של gDNA מופק הזנב של דג זברה בוגרת הזרקת CRISPR. עוברים הוזרקו עם sgRNA ו Cas9 חלבון גדלו לבגרות (3 חודשים). דגים B ו- C בנספח heteroduplex להקות, שנולדו לאחר מכן כדי לזהות germline ששודרו indels; דג שימש לא חשפה כי היא לא הכריזה להקת heteroduplex חיובי. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דג; 3 = דגים ב'; 4 = דג ג צפוי במידה = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> איור 6 : Heteroduplex assay ניידות של אחד העוברים שנוצרו על-ידי גידול דג המוזרק F0 CRISPR כדי דג פראי-סוג כדי לזהות germline ששודרו indels. דג זברה היו הזדווגו, העוברים F1 פותח עבור עוברי יחיד ה 72 שנאספו, ניתוח heteroduplex שבוצעה כמתואר. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2-10 = של העובר F1 יחיד לכל ליין. ג'ל זה מראה כי 7 מתוך 10 עוברי להראות להקה heteroduplex חיובית, המציינת את קצב שידור germline של 70% ויאסין. צפוי במידה = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> איור 7 : Heteroduplex assay ניידות של קליפים זנב של דג זברה F1 למבוגרים. דגים F1 למבוגרים היו שבוים על ידי HMA לזיהוי indels. דג זה הציג להקה heteroduplex חיובי היו PCR מוגבר וזקוק לניתוח רצף רחב כדי לקבוע את טיב המוטציה. (א) מסלולים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דגים (4 bp מחיקה, אי התאמה 1 bp). דגים (B) F1 אלה זוהו המייסד באותו, ועדיין להראות שונה heteroduplex תכנים, המציין germline שידור של אללים מרובים ששונה מ יסוד בודד. נתיבים: 1 = שליטה פראי-סוג; 2 = דגים B (הכניסה bp 4, 7 אי-התאמה של bp), 3 = דגים C (מחיקה bp 4, 4 אי-התאמה של bp). כל אחד indels אלה יצרו codon עצירה מוקדמת של קידוד רצף הגן היעד, כפי שנקבע על ידי המיתרים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio at JoVE.com

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...