Name: efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (R21CA182197) için Albay Ralph W. ve Grace M. Douchez araştırma güven, Purdue tarım bilim ve ekonomik kalkınma (AgSEED) programı için uzantısı tarafından. Sanger sıralama veri P30 CA023168 tarafından desteklenen Purdue genomik çekirdek tesis tarafından satın alınan. Mary Witucki Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından Carroll bölgesi Kanser Derneği tarafından desteklenen kanser araştırma yaz lisans araştırma programı için destek verdi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. Biz Benjamin Carter, Ellen Denning ve Taylor Sabato el yazması üzerinde kritik geribildirim sağlamak için teşekkür ederiz. Biyokimya Bölümü için destek bu çalışmanın ve onların bağlılığı bakım ve zebra balığı kolonimiz refahı için Purdue Üniversitesi'nde zebra balığı araştırma merkezi teşekkür ederiz. Son olarak, Purdue genomik çekirdek tesisin teşekkür ediyoruz ve Phillip San Miguel katkılarıyla NGS Hizmetleri ile ilgili.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı gen knockouts üretim CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı omurgalı modeli sistemde açıklar. Bir dizi protokolü daha önce zebra balığı15,25,26,50,51,52CRISPR-aracılı genom mühendislik taahhüt tarif edilmiştir. Bu iletişim kuralı önceki çabaları bir takım basit ama tekrarlanarak tutarlı Deneysel teknikler, özellikle bir araya getirerek HMA ve NGS birden çok basit, ekonomik, oluşturmak için Heterozigoz balık ve deneysel olarak sağlam iletişim kuralı oluşturur CRISPR-aracılı ile personel eğitim ve deneyim yanı sıra labs öğretim yelpazesi ile personel labs için uygundur zebra balığı içinde mutagenesis için.
Tasarım ve RNA'ların bu protokol için dahil edilen Kılavuzu sentezi için öneriler. Bir büyük RNA tasarım kılavuzundaki hedef kapalı etkileri indirilmesi noktadır. CRISPR-kullanıcıların hem hedef üzerinde Kılavuzu etkinlik ve hedef kapalı etkileri34, olasılığını tahmin Kullanıcı dostu grafik arayüze sahip hesaplama araçları erişmesine izin vermek için çeşitli tahmin algoritmalar geliştirilmiştir 35,36. Zebra balığı sistemin belirli bir avantajı hedef kapalı etkileri indirdi oranları Cas9 embriyo enjekte edilir ve bu nedenle ifade hangi farelerde azalmış hedef kapalı etkileri53neden olarak gösterilen geçicidir, çünkü. Bununla birlikte, hedef kapalı etkileri zebra balığı54yılında gerçekleşmesi için gösterilmiştir. Bir denetim için hedef sonuç için bu kılavuzların farklı hedef kapalı sitelerini etkileyen büyük olasılıkla olacak gibi bu aynı gen hedefleyen iki bağımsız Kılavuzu RNA'ların tarafından oluşturulan fenotip kurucusu zebra balığı için yoludur. Bu iletişim kuralında tanımlanan hedef kapalı etkileri en aza indirmek için alternatif bir yöntem olan yüksek verimlilik ile tamir tek kırılmalara DNA, target oluşturur bir mutasyona uğramış Cas9 kullanmaktır. Tersi tamamlayıcı DNA nickler birbirine yakınlığı içinde eşleştirme istenen odağı, etkili INDEL oluşumunda sonuçları ayrılmaktadır ve hedef kapalı etkileri55,56en aza indirir.
Hedef kapalı etkileri farklı oranlarda sahip olmanın yanı sıra, farklı sgRNAs mutagenesis istenen hedef57,58,59farklı oranlarda olabilir. Bu protokol heteroduplex band oluşumu33,40kullanarak belirli bir sgRNA mutagenesis verimliliğini analiz etmek HMA kullanır. Heteroduplex grupları ve uyuşmazlıkları içeren jel elektroforez kullanılarak kolayca çözülebilir PCR tarafından oluşturulan DNA iplikçiklerinin hibridizasyon tarafından oluşturulur. INDEL oluşumu ölçmek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlerin aksine T7 endonükleaz gibi tahlil veya yüksek çözünürlüklü eritmek analiz25,26, HMA eşleşmeyen DNA kesmek için pahalı bir enzim does değil istemek ve does değil istemek karmaşık analizini PCR eğrileri eritebilir. Önemlisi, HMA INDEL oluşumu enjekte nüfus yüksek oranda doğrulamak için kullanmak da bir mutasyon ile belirlenmesi maliyetini azaltan sonraki knock-out satırları, üretim için gerekli balık sayısını en aza indirmek için Dedektif, sağlar istenen özellikleri.
CRISPR tabanlı indels üreten göreli kolaylığı aynı anda birden çok gen birden çok gen oluşturulmasını sağlar. Web tabanlı yazılım, heterozigoz balık Sanger kullanarak tek mutasyon analizi için kullanılabilir PCR ürünleri49sıralama. Nerede üç veya daha fazla CRISPR mutasyona uğramış gen analiz edilir, NGS INDEL doğası karakterize etmek için büyük olasılıkla daha bu yaklaşım olarak INDEL doğası karakterize etmek için uygun maliyetli olmak o karakterize edilebilir için en çok 50 farklı gen havuzu sağlar durum nce (bakınız Tablo reçetesi)60,61,62. Böyle ölçek ekonomisi büyük olasılıkla bir lisans laboratuvar ortamında özellikle yararlı olacaktır.
Özet olarak, bu iletişim kuralı daha az yetişkin balık oluşturulabilir ve başarılı bir şekilde ilgi, mutant gen belirlemek için çözümlenebilir gerekir öyle ki tekrarlanarak yüksek kalitede CRISPR-reaktifler (özellikle sgRNA) oluşturmak için adım adım yönergeler sağlar hangi Ayrıca zaman ve istenen satırlar maliyetini azaltır. Önemlisi, bu iletişim kuralı mutant zebra balığı uygun bir şekilde üretmek için sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar tarafından uygulanabilir öyle ki tasarlanmıştır. Ayrıca, biz bulduk bu yaklaşım lisans öğrencileri için uygundur ve böylece eğitim ve öğretim lisans öğrencilerinin uygulamalı deneyim genom CRISPR tabanlı düzenleme ilgi için fırsatları genişletir.

Ökaryotlar arasında Moleküler makineler korunması için araştırma model organizmalar kullanarak güç altında yatan. Bu modeli sistemlerin pek çok gen ürünü bir biyolojik veya hastalık işleme ilgi katkısını karakterize etmek için hedeflenen gen altını gizleme gibi ters genetik yaklaşımlar kullanımını kolaylaştırmak. Gene bozulma teknikleri zebra balığı gibi organizmalar üzerinde DSBs1,2imprecise tamiri neden frameshift mutasyonların hedeflenen giriş tarihsel yararlanmıştır. Bir DSB genom tanıttığında, DNA lezyon neredeyse tüm hücre tipleri ve organizmaların evrensel olarak mevcut iki yolları biri aracılığıyla tamir: homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR)3,4 . NHEJ makine imprecise doğası sık sık çeşitli uzunlukları5,6,7,8,9indels üretir. Giriş bir genin kodlama dizisi frameshift mutasyonların kez gen işlevsel olmayan işler bir erken kodonu, üretebilir.
Meganucleases, çinko-parmak nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz, tüm bunların bir nükleaz genomik belirli bir hedef için DNA-protein etkileşimler kullanılan zebra balığı indels tanıtmak için erken genom mühendislik stratejileri dahil hedef nerede DSB10,11,12,13,14,15tanıttı. Ancak, bu teknolojilerin genellikle faiz DNA dizisi hedefleyen bir nükleaz görüntüyü artırmak için gerekli zahmetli ve karmaşık mühendislik nedeniyle uygulamak zordur. Önceki stratejileri gen CRISPR tabanlı düzenleme hedefleme için protein-DNA etkileşimleri dayanmaz. Bunun yerine, CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz nükleotit etkileşimleri eşleştirme temel faiz16,17,18,19 genomik bir site hedeflemek için kullandığı bir RNA Kılavuzu yönlendirilir ,20,21. Bir RNA tasarlama basitliği nedeniyle Kılavuzu ile etkileşimleri bu hedefleme için eşleştirme istenen Bankası Cas endonükleaz istenen odağı için hedef nispeten kolaydır. Tip II CRISPR sistemi özellikle yaygın endonükleaz etkinliği uyarmak için DNA ile etkileşim gerektiren bir tek etki alanlı Cas nükleaz (Cas9) kullanımı da dahil olmak üzere birçok avantajlı özellikleri nedeniyle genom düzenleme uygulamaları için geliştirilmiştir ve soydaş DNA dizisi18için hedef için bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) kullanın. Sıra gereksinimleri soydaş sgRNA hedefleme için gerekli iyi anlaşılan19, ve istenen sgRNA kolayca vitro transkripsiyon tarafından oluşturulur. Sadelik ve sağlamlık CRISPR/Cas9 yaklaşımın büyük zebra balığı ve diğer organizmalar zengin çeşitte hedeflenen genetik değişiklik kolaylaştırır.
Zebra balığı reaktifler CRISPR tabanlı geliştirme sonucu olarak hedeflenen genom düzenleme önemli ölçüde vardır taahhüt yeteneği gelişmiş omurgalı canlıların sinir merkezi geliştirme gibi sembolik işlemler çalışma fırsatı arttı sistem. Zebra balığı genom orthologs insan genomu hem de insanlar22hastalıkları ile ilişkili genlerin % 84 bulundu protein kodlayıcı genlerin % 70 içerir. Zebra balığı geliştirme sergileyen kullanımı ters genetik çalışmalarda geliştirmek birkaç anahtar nitelikler: embriyo büyük debriyajlar koyulur, dışarıdan mikroenjeksiyon ve yetişkin zebra balığı tarafından mükellef genetik manipülasyon geliştirmelerde anneden geliştirmek 3 ay-in yaş, istediğiniz satırları23hızlı yayılması için izin tarafından cinsel olgun.
Çok sayıda iletişim kurallarının yaklaşımlar oluşturmak ve CRISPR elde edilen indels zebra balığı24,25,26,27,28,29 olarak tanımlamak için çeşitli tarif ,30,31. Ancak, bu yordamları birçoğu zaman yoğun, pahalı ekipmanlara erişim gerektiren ve labs ile sınırlı uzmanlık için zor olabilir. Burada açıklanan adımları bir basit, sağlam ve ekonomik CRISPR/Cas9-stratejisi mühendis zebra balığı nakavt satırlarına sağlayabilir. Bu iletişim kuralı DNA oligonucleotides (oligos) kullanarak sgRNAs sentezlemek için son derece verimli bir kit açıklar, benzer olmuştur diğer yaklaşımlar için daha önce açıklanan32. Açıklanan protokol iki adımları özellikle büyük ölçüde kolaylaştıran çizgiler CRISPR mutasyona uğramış analizini içerir: adım adım kolayca genom değişiklikler varlığı ve sıralama Analizi belirlemek için PCR tabanlı HMA33 kullanımı hızla ve kolayca birden çok indels ekonomik bir biçimde sebebini bulmaya Heterozigoz zebra balığı. Buna ek olarak, adım adım yönergeler seçimi sağlam, güvenilir üretim ve Enjeksiyon Kılavuzu RNA'ların için dahil edilir. Burada sağlanan adımlar zebra balığı gen knockouts tanımlaması için katkıda bulunmak laboratuar personeli uzmanlık bir dizi sağlayan sağlam, nispeten ucuz protokol örnekler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CRISPOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breaking-Cas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChopChop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free technique</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free ethanol</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Cas9 protein with nuclear localization signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target specific oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen sgRNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E3322</td>
			<td>In vitro transccribe guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td>RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Load Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>Loading DNA for electropheresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof, nuclease-free)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For synthesis and purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10328011</td>
			<td>Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0467S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 1 kb</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0552S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0364S</td>
			<td>Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Polyacrylamide (19:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0154</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-100G</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td>Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Visualization of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S7563</td>
			<td>Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>RNA clean up, PCR purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21105</td>
			<td>For amplification of DNA using PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>PCR amplification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo media</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td>Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB0875711Z</td>
			<td>Store embryos, cast injection plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CA3510-8</td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To create wells to hold embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290&#160;</td>
			<td>Dye for visualization of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>To calibrate needle injection volume.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Moving embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Cutting injection needle, tail clipping adult fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Maintaining embryos at 28.5 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td>Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Geneate needles for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Load solution into injection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 820</td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Polyacylamide (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td>Heteroduplex gel casting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>To expell liquid from the capillary for embryo injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Sequencing platform: Wideseq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio

Kümelenmiş, karakterizasyonu düzenli olarak interspaced, Streptococcus pyogenes (CRISPR) sistemi hızla geniş çeşitli gen değişiklikleri oluşturmak için özelleştirilebilir bir platform gelişimi sağladı kısa, palindromik tekrar organizmalar, zebra balığı da dahil olmak üzere. Genom CRISPR tabanlı düzenleme tek kılavuz RNA (sgRNA) CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz ilgi, genomik DNA (gDNA) hedefine hedeflemek için nerede iki iplikçikli mola (DSB) Cas endonükleaz oluşturur kullanır. DSBs onarım hataya mekanizmaları kurşun eklemeleri ve/veya silme (indels) tarafından. Bu kez erken kodonu böylece bir protein-null alleli oluştururken kodlama dizisi içinde tanıtmak frameshift mutasyonlar neden olabilir. CRISPR tabanlı genom mühendislik yalnızca birkaç moleküler bileşenleri gerektirir ve kolayca zebra balığı embriyo mikroenjeksiyon tarafından tanıtıldı. Bu iletişim kuralı CRISPR kimyasalları zebra balığı mikroenjeksiyon üretmek için ve CRISPR modifiye gen aktarımını germline sergilenmesi balık tanımlamak için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu yöntemler, sgRNAs, mikroenjeksiyon, CRISPR reaktifler, indels bir heteroduplex hareketlilik tahlil (HMA), malzemelerin ve indels adı verilen bir PCR tabanlı yöntem kullanarak hedef sitesinde indüklenen tanımlaması içinde vitro transkripsiyon içerir iş hızı düşük ve güçlü yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak-Heterozigoz balık toplanan birden fazla PCR ürünleri analiz edebilirsiniz yaklaşım alarak. Bu iletişim kuralı çözümlemesi için gerekli ekipman türleri ve gerekli balık sayısını en aza indirmek için kesintisiz hale getirilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı kullanımı için mükellef olarak laboratuvar Kişisel lisans öğrencileri, ekonomik olarak CRISPR tabanlı gerçekleştirmede baktılar herhangi bir araştırma grubu tarafından istihdam edilecek bu güçlü aracı etkinleştirme dahil deneyimi her seviyedeki tarafından tasarlanmıştır zebra balığı genomik değişiklik.

Bu protokol için açıklanan deneysel yaklaşımlar zebra balığı knock-out satırları CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak verimli, düşük maliyetli üretim için izin. Aşağıdaki şekiller yorumu ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen sonuçları sorun giderme kolaylaştırmak için bu makalede dahil edilmiştir. Başarılı bir üretim ve CRISPR-reaktifler mikroenjeksiyon, zebra balığı embriyo aleni fenotipleri ve HMA kullanarak INDEL oluşumu için analiz edilebilir. CRISPR-deney başarısı görselleştirmek için yardımcı bir denetim içinde adım 1.5-pigment üreten gen hedeflemek için açıklanan sgRNA kullanmaktır tirozinaz. Cas9 kaynaklı INDEL oluşumu tirozinaz , pigmentasyon kaybına neden olur ve 48 tarafından kolayca attı hpf (Şekil 1). CRISPR-reaktifleri o hazırlanması için enjeksiyon başarılı oldu sağlamak için başka bir yararlı olduğu bu tam uzunlukta doğrulamak için (120 nt) sgRNA sentez bir denaturing polyacrylamide jel (Şekil 2, Lane 1 ve 2) kullanarak. RNA bozulmuş o görünür bir smear örneğin enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş RNA Lane 3 (resim 2) gösterir.
Tirozinaz, gibi açık fenotipleri neden değil CRISPR-Cas9 tarafından hedef genlerin INDEL oluşumu sıklığı çözümlenecek HMA bir basit ve güvenilir yöntem analizidir. sgRNA/Cas9 heteroduplex Grup oluşumu ve homoduplex grubu (Şekil 4) yoğunluğunu azalması HMA sonuçları kullanılarak analiz embriyo enjekte. Heteroduplex bant varlığı daha fazla potansiyel kurucusu balık microinjected embriyo aldı ve bir kurucu ( germline iletim verimliliğini analiz etmek için yetişkin (Şekil 4 ve Şekil 5), belirlemek için bu iletişim kurallarını kullanılmaktadır Şekil 6) ve bir INDEL Heterozigoz F1 balık (Şekil 7) varlığını doğrulamak için. Bir INDEL içeren Heterozigoz balık NGS INDEL doğasını belirlemek için ve erken kodonu hedef genin kodlama bölgede mevcut olup olmadığını belirlemek için adaylarıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Resim 1 : Zebra balığı embriyo bir sgRNA tek hücreli aşamada tirozinaz hedefleme ile enjekte edildiğinde bir pigment kusur sergi. (A)vahşi-türü, uninjected embriyo 48 hpf ve (B) enjekte embriyo 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Resim 2 : SgRNA sentez seti kullanarak, vitro transkripsiyonu. Oligos vitro transkripsiyon sgRNA sentez kiti talimatlara göre kullanarak sentez. 500 ng RNA'ın açıklandığı gibi bir üre/sayfa jel üzerinde çalıştırmak. 1 ve 2 şerit yüklü sgRNA tam uzunlukta, bozulmadan 120 nt RNA karşılık gelen bir grup gösterir. Şeritte 3 sgRNA enjeksiyon için uygun değildir bozulmuş bir RNA örnek gösterir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Şekil 3 : 24 enjekte hpf embriyo sağlık karşılaştırılması. Bir yaşam embriyo(a)geliştirilen 24-hpf, geliştirme (B) iptal edildi bir embriyo kolayca ayırt. (B) benzer veya büyük ölçüde olan embriyo gibi omurilik eğriliği (a), özellikleri değiştirmiş veya değiştirebileceği kafa ve göz geliştirme yemek kaldırılmalıdır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Şekil 4 : SgRNA-Cas9 Heteroduplex hareketlilik tahlil microinjected zebra balığı embriyolar. Örnek başına 5 embriyo takımlık 72 toplanan hpf ve gDNA elde. Heteroduplex çözümlemenin açıklandığı gibi örnekleri eşit 500 ile doluydu ng DNA'ın. Şerit: M = 100 bp işaret; 1 = uninjected denetimi; 2 = enjeksiyon örnek 1; 3 = enjeksiyon örnek 2. Beklenen Grup boyutu = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Şekil 5 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı kuyruk çıkarılan gDNA. Bir sgRNA ve Cas9 protein enjekte edildi embriyo yetişkinliğe (3 ay) yetiştirilmiştir. Balık B ve C heteroduplex Grup Sergi ve daha sonra iletilen germline indels tanımlamak için bred; bir pozitif heteroduplex grup göstermez çünkü Balık A daha sonraki analiz alışık değildi. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık A; = 3 balık B; = 4 = balık C. beklenen Grup boyutu = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Şekil 6 : Heteroduplex hareketlilik tahlil F0 CRISPR enjeksiyonlu zebra balığı aktarılan germline indels tanımlamak için bir vahşi tipli balık yetiştiriciliği tarafından oluşturulan tek embriyo. Zebra balığı çiftleş ve 72 h. tek embriyo için yetiştirilen F1 embriyo toplanmıştır ve heteroduplex çözümleme açıklandığı gibi yapılır. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2-10 lane başına tek bir F1 embriyo =. Bu jel 7 dışarı-in 10 embriyo INDEL % 70'i germline iletim hızıyla belirten bir pozitif heteroduplex grup show gösterir. Beklenen Grup boyutu = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Şekil 7 : Heteroduplex hareketlilik tahlil yetişkin F1 zebra balığı kuyruk klip. Yetişkin F1 balık indels tanımlamak için HMA tarafından skorlanmıştır. Bir pozitif heteroduplex grup sergilenen balık mutasyon doğasını belirlemek için güçlendirilmiş ve geniş sıralama analiz için gönderilen PCR vardı. (A)şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp silme, 1 bp uyuşmazlığı) =. (B) bu F1 balık aynı kurucusu tespit edilmiştir ve henüz desenlendirme, tek bir kurucusu birden çok değiştirilmiş gen aktarımını germline gösteren farklı heteroduplex göster. Şerit: 1 = vahşi tipi kontrol; 2 balık (4 bp ekleme, 7 bp uyuşmazlığı), B = 3 balık C (4 bp silme, 4 bp uyuşmazlığı) =. Her biri bu indels NGS tarafından belirlenen hedef gen kodlama dizisi içinde erken kodonu oluşturdu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio at JoVE.com

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...