Name: clonal analysis of embryonic hematopoietic stem cell precursors using single cell index sorting combined with endothelial cell niche co-culture
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden nel Fred Hutchinson flusso Cytometry nucleo per assistenza con FACS. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione di istituti nazionali di salute NHLBI UO1 #HL100395, accessorie collaborativo Grant #HL099997 e NIDDK concedere #RC2DK114777. Brandon Hadland è supportato da di Alex Lemonade Stand della Fondazione e Hyundai Hope su ruote Foundation.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. preparazione di monostrati AGM-CE per la co-cultura
<ol><li>24 h prima della dissezione AGM e ordinamento, fare filtro sterilizzare e terreni di coltura AGM-CE.</li>
	<li>Aggiungere la gelatina di 0,1% in acqua (100 µ l/pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aspirato la gelati...

<ol>
	<li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage.">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li><li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells/long-term+repopulating+units+(HSC/RUs):+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+(AGM)+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver.">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li><li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin+CD45++pre-definitive+HSCs.">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region.">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent,+IL-3-independent+CD43(-)+embryonic+precursor.">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection.">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li><li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region.">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li><li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations.">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li><li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus.">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes.">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li><li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis.">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li><li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells.">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells.">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells.">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells.">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li><li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations.">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li><li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM.">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta.">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li><li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis:+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression.">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li><li>Holmes, R., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).</li><li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo.">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf&#946;+for+their+development.">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbf&#946; for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li><li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence.">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li><li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development.">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li><li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis:+emergence+of+erythroid,+megakaryocyte,+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo.">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li></ol>

Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazi...

Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento1. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche2. Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto in destinatari adulti condizionati, non vengono rilevati fino a dopo giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nell'embrione murino, a bassissima frequenza3 . Durante il loro sviluppo, precursori di HSC (pre-HSC) derivanti dall'endotelio hemogenic devono essere sottoposti a maturazione prima di acquisire la proprietà di HSC adulto che consentono per efficiente attecchimento nel trapianto saggi4,5 , 6. oscurando lo studio rari HSC origine, una moltitudine di progenitori ematopoietici con degli eritrociti, mieloidi e linfoidi potenziale sono già individuati prima l'emergere di HSC da pre-HSC7,8. Così, distinguendo pre-HSC da altri progenitori ematopoietici richiede metodi clonally isolare cellule e fornire loro i segnali sufficienti per la loro maturazione per HSC, per rilevare le loro proprietà di attecchimento in saggi di trapianto.
È state descritte una serie di approcci che consentono il rilevamento di pre-HSC di maturazione sia ex vivo o in vivo di HSC. Ex vivo metodi hanno dipendeva da coltura di tessuti embrionali, come la regione AGM, dove il primo HSC vengono rilevati in sviluppo9. Sulla base di questi metodi, protocolli che incorporano la dissociazione, l'ordinamento e ri-aggregazione dei tessuti AGM hanno permesso la caratterizzazione delle popolazioni ordinati contenenti precursori di HSC durante lo sviluppo da E9.5 per E11.5 in para-aortica Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioni4,5,10; Tuttavia, questi approcci non sono suscettibili di analisi di alto-rendimento dei precursori a livello di singola cellula necessari per l'analisi clonale. Allo stesso modo, maturazione in vivo da trapianto in topi neonati, dove il microambiente è presunta per essere più adatto per il supporto delle precedenti fasi di precursori HSC, ha permesso anche gli studi delle popolazioni ordinati dal sacco vitellino e AGM / P-Sp (P-Sp è la regione di precursore per l'AGM) con caratteristiche di pre-HSC, ma questi metodi anche non riescono a fornire una piattaforma robusta per singola cella analisi11,12.
Gli studi da Rienzi et al hanno dimostrato che quello stroma Akt-attivata delle cellule endoteliali (EC) può fornire un substrato di nicchia per il supporto dell'adulto HSC auto-rinnovamento in vitro13,14,15. Abbiamo recentemente hanno determinato che la CE Akt attivato derivato dalla regione AGM (AGM-CE) fornisce una nicchia adatta in vitro per la maturazione dei precursori hemogenic, isolato più presto E9 in sviluppo, per HSC adulto-capacità di integrazione, così come la successiva auto-rinnovamento di generato HSC16. Dato che questo sistema utilizza una semplice 2-dimensionale co-coltura, è facilmente adattabile per analisi clonale del potenziale HSC di precursori hemogenic individualmente isolato.
Recentemente abbiamo segnalato un approccio di saggiare le potenzialità HSC di precursori hemogenic clonale combinando Indice ordinamento dei precursori hemogenic individuali da embrioni murini con AGM-CE co-cultura e successiva analisi funzionale nel trapianto analisi di17. Indice di ordinamento è una modalità di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) che registra (indici) tutti i parametri fenotipici (cioè, parametri di forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescenza) di ciascuna cella individualmente ordinato tale che questi caratteristiche possono essere correlati in modo retrospettivo per successiva analisi funzionale seguendo l'ordinamento. FACS software registra sia informazioni fenotipiche per ogni cella e la posizione/pozzetto della piastra 96 pozzetti in cui è stato disposto. Questa tecnica è stata utilizzata precedentemente elegantemente per identificare eterogeneità nell'adulto HSC, determinare parametri fenotipici che ulteriormente arricchiscono per il sottoinsieme di attecchimento a lungo termine di HSC e correlano parametri fenotipici di HSC con trascrizionale Proprietà presso la singola cella livello18,19. Qui, forniamo metodologia dettagliata di questo approccio che consente l'identificazione di parametri univoci fenotipici e contributi di lignaggio di pre-HSC durante le prime fasi dello sviluppo embrionale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AGM-EC culture media </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for culture of endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td>Use to dissociate AGM-EC monolayers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Use for dissection and FACS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml filter bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>9741202</td>
			<td>Use to sterile filter Endothelial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM-EC culture media (500 mls)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>400 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>100 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>5 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td>50 mg dissolved in 10 mls media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7100</td>
			<td>5 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Mitogen (ECGS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64516 (BT-203)</td>
			<td>Add 10 mls media to dissolve and add</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for AGM index sort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (0.25%)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7902</td>
			<td>Use for dissociation of embryonic tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309657</td>
			<td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M syringe-driven filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>Use to remove cell clumps prior to FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>268298</td>
			<td>Use to exclude dead cells from sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>Use to block non-specific staining to Fc receptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for AGM index sort</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-1441-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4301-81</td>
			<td>Isotype control for CD144 PE-Cyanine7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-2012-80</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-4031-80</td>
			<td>Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD41 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558040</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553925</td>
			<td>Isotype control for CD41 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0451-85</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4031-81</td>
			<td>Isotype control for CD45 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM-serum free media (10mls)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo 20</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-448Q</td>
			<td>10 mls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine stem cell factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine interleukin-3 (IL3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for Staining co-cultured cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td>Use for FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-0451-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>35-4031-80</td>
			<td>Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-2012-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4031-81</td>
			<td>Isotype control for CD201 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5981-83</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-4321-81</td>
			<td>Isotype control for Ly-6A/E APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4801-81</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-4321-41</td>
			<td>Isotype control for F4/80 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553127</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556923</td>
			<td>Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for tail vein injection for transplant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309306</td>
			<td>Use for tail vein injection for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108426</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400629</td>
			<td>Isotype control for Ly-6G/C PerCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4321-80</td>
			<td>Isotype control for F4/80 PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555274</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550992</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td>Isotype control for CD19 APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0453-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-4321-81</td>
			<td>Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0454-82</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-4321-80</td>
			<td>Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II with DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II with plate reader</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17040</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-559-417</td>
			<td>For dispensing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS analysis software</td>
			<td>FlowJo/BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal analysis of embryonic hematopoietic stem cell precursors using single cell index sorting combined with endothelial cell niche co-culture

La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.

Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina+EPCRalta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per...

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Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

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Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...