Name: a method for targeted 16s sequencing of human milk samples
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

ברצוננו להודות Helty Adisetiyo, PhD, Shangxin יאנג, PhD לפיתוח של הפרוטוקול. הכוללת תמיכה עבור הבינלאומי אימהי בילדים מתבגרים איידס קליניים ניסויים קבוצה (IMPAACT) סופק על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של במכון הלאומי של בריאות (NIH) תחת מספרי פרס UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC), UM1AI106716 (IMPAACT LC), עם השתתפות במימון המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר של ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD), את נבחרת המכון לבריאות הנפש (NIMH). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.

עבור כל פרוטוקול השלבים, חובה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי), גישות למניעת זיהום מחמירים צריכים להילקח. לבחון את זרימת העבודה מן קדם הגברה לעבוד אזורים לאזורים הגברה שלאחר עבודה כדי למזער את הזיהום של דגימות. כל ציוד המשמש הן סטרילי, ללא RNase, DNase, ה-DNA ו- pyrogen. כל הטיפים פיפ?...

<ol>
	<li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system.">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li><li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Holobiont:+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System.">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li><li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental,+tongue,+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity.">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).</li><li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome.">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).</li><li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects:+Tools,+techniques,+and+challenges.">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+human+microbiome+research.">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research.">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52 (2017).</li><li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing:+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing.">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561 (2017).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome.">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li><li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study.">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li><li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk.">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li><li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8(+)+T+cells+in+human+breast+milk.">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li><li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women.">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li><li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk.">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li><li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+DNA/RNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses.">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588 (2016).</li><li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants.">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).</li><li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease.">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li><li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota.">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29 (2016).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87 (2014).</li><li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice.">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26 (2015).</li><li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples.">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24 (2016).</li><li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles.">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies.">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).</li><li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+human+lower+airways:+a+next+generation+sequencing+perspective.">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).</li><li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract.">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li><li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing.">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).</li><li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data.">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19 (2015).</li><li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking.">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li><li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR.">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73 (2016).</li><li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genetics+and+Gut+Microbiome:+Challenges+and+Perspectives.">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li><li>. Mock microbial communities Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017)</li></ol>

רצף יישוב הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA היא טכניקה בשימוש נרחב, מהיר microbiome אפיון18. עם זאת, גורמים רבים, כולל אפקטים אצווה, זיהום סביבתי, זיהום, לדוגמה, רגישות הפארמצבטית יכול להשפיע לרעה להשפיע על תוצאות הניסוי, וחיסול7,שלהם פרשנות19 , 20<...

הקהילות אותן מיקרוביאלי לישוב בני האדם מאמינים כי חשובה ביותר לבריאות האדם ומחלות המשפיעים על חילוף החומרים, פיתוח המערכת החיסונית, נטייה למחלות, תגובות חיסון התרופות, טיפול1, 2. מאמצים כדי להבין את השפעת microbiota על בריאות האדם כיום מדגישים את הזיהוי של מיקרובים המשויכות מוגדרים תאים אנטומיים (כלומר, עור, בטן, אוראלי, וכו '), כמו גם אתרי מקומי בתוך אלה3,תאים4. המאמצים האלה החקירות לגורם המרכזי עליו מושתתת היא התפתחותה המהירה של נגישות מוגברת של טכנולוגיות הדור הבא רצפי (הגדרות) המספקים פלטפורמה בנפט במקביל לניתוח של התוכן הגנטי מיקרוביאלית (microbiome) של מדגם. לדוגמאות פיזיולוגיים רבים, microbiome המשויך הוא מורכב וגם בשפע (קרי, צואה), אבל עבור כמה דוגמאות, microbiome מיוצג על-ידי ביומסה מיקרוביאלית נמוך (כלומר, חלב, מערכת הנשימה התחתונה) שבו רגישות, חפצי אמנות ניסויית, זיהום אפשרי להפוך את הנושאים העיקריים. האתגרים המשותפים של microbiome לימודי עיצוב ניסיוני המתאים כבר הנושא של מספר סקירת מאמרים5,6,7,8.
שהוצגו במסמך זה צינור ניסיוני חזק המיתרים מבוסס על רצף יישוב של rRNA 16 שכבת ביטול v4 של אזור9 כדי לאפיין את microbiome של חלב. ניתוח Microbiome של חלב אינו מורכב רק על ידי נמוך מטבעו ביומסה מיקרוביאלית של10, אך בנוסף על ידי גבוהה רמות של דנ א אנושי רקע11,12,13,14 ו דחויים פוטנציאלי של PCR מעכבי15,16 בחומצות שחולצו. פרוטוקול זה מסתמך על ערכות חילוץ זמינים מסחרית, פלטפורמות חצי אוטומטיים כדי לסייע במזעור השתנות לאורך אצוות הכנת המדגם. הוא כולל קהילה מדומה חיידקי מוגדרים היטב, שמעובד לצד דוגמאות כמו בקרת איכות כדי לאמת כל שלב בפרוטוקול ולספק מדד עצמאית של צינור חוסן. אמנם הפרוטוקול כפי שתואר ספיציפית דגימות חלב, ניתנת להתאמה בקלות סוגים אחרים דוגמת כולל צואה, בפי הטבעת, בנרתיק, עור, מטליות מונטגומרי, אוראלי10,17, והוא יכול לשמש נקודת מוצא חוקרים המעוניינים לבצע ניתוח microbiome.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">80204</td>
			<td style="width:395px;">DNA/RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eliminase</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">435532</td>
			<td>RNase, DNase, DNA decontaminant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Thermo Mixer</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>temperature-controlled vortexer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Buffer RLT plus</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>1053393</td>
			<td>guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#223;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>63689-25ML-F</td>
			<td>&#223;-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LME Beads</td>
			<td style="width:115px;">MP Biomedicals</td>
			<td>116914050</td>
			<td>bead tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen TissueLyzer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>automated sample disruptor adapter set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAshredder column</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>&#160;79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAgen RB tube</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
			<td>manufacturer&#39;s microcentrifuge tube in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAcube and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001292</td>
			<td>automated DNA/RNA purification instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">DNA exitus plus</td>
			<td style="width:115px;">Applichem</td>
			<td>A7089</td>
			<td>non-enzymatic decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">EB Buffer</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">19086</td>
			<td>elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAgility and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td>9001532</td>
			<td>robotic liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR water</td>
			<td style="width:115px;">MO BIO</td>
			<td>17000-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5PRIME HotMasterMix</td>
			<td style="width:115px;">Quantabio</td>
			<td>2200400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Barcoded reverse primers</td>
			<td style="width:115px;">Eurofin</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>designed and ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">&#160;96 well PCR plate</td>
			<td style="width:115px;">USA scientific</td>
			<td style="width:153px;">1402-9708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Tapestation 2200 and related plasticware</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td>automated DNA/RNA fragment analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D1000 reagents for Tapestation&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>Sample buffer and ladder are part of this kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneStep PCR Inhibitor Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:153px;">50444470</td>
			<td>PCR inhibitor removal is done per the manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td style="width:153px;">28104</td>
			<td>DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;">Q32854</td>
			<td>dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq 300 V2 kit</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td>15033624/15033626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">MiSeq&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Illumina</td>
			<td style="width:153px;">No Catalog #&#39;s</td>
			<td>next generation sequencer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for targeted 16s sequencing of human milk samples

מחקרים של קהילות מיקרוביאלי הפכו נרחבת עם הפיתוח של רצפי התפוקה יחסית זול, מהיר וגבוה. עם זאת, כמו עם כל הטכנולוגיות הללו, תוצאות לשחזור תלויות שזרימת עבודה במעבדה משלבת אמצעי הזהירות המתאימים ופקדים. דבר זה חשוב במיוחד עם דגימות נמוך-ביומסה איפה לזיהום חיידקי ה-DNA ניתן להפיק תוצאות מטעות. מאמר זה מפרט זרימת עבודה אוטומטית למחצה כדי לזהות חיידקים מדגימות חלב בשד האנושי באמצעות רצף יישוב של אזור V4 ribosomal RNA (rRNA) 16 בסולם נמוך - עד אמצע - throughput. הפרוטוקול מתאר הכנת הדוגמא של חלב מלא כולל: לטעום פירוק, חילוץ חומצת גרעין, הגברה של אזור V4 של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין, וכן ספריית הכנה עם אמצעי בקרה. חשוב, הפרוטוקול ואת הדיון לשקול סוגיות שאינן בולטות הכנה, ניתוח דוגמאות נמוך-ביומסה לרבות הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים, הסרת המעכב PCR, דוגמת זיהום על ידי הסביבה, מגיב, או מקורות ניסיוני, ושיטות עבודה מומלצות ניסיוני, שנועדו להבטיח הפארמצבטית. בעוד הפרוטוקול כפי שמתואר ספיציפית דגימות חלב, זה יכולת הסתגלות רבים סוגי דגימה ביומסה נמוכה ולא גבוהה, כולל דוגמאות שנאספו על דגימות, קפוא מסודר, או התייצב במאגר שימור.

פרוטוקול המוצג כאן כולל שלבים חשובים בקרת איכות (QC) כדי להבטיח כי הפגישה נתונים שנוצרו ובחינות עבור פרוטוקול בקרת רגישות, ירידה לפרטים, זיהום. הצעד הראשון של הפרוטוקול QC בעקבות PCR הגברה של אזור V4 16 (איור 2). µL אחד של מוצר ה-PCR של כל מדגם נותחה על ידי אלקטרופורז...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples at JoVE.com

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...