Name: simultaneous measurement of superoxide/hydrogen peroxide and nadh production by flavin-containing mitochondrial dehydrogenases
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases at JoVE.com

Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). Production vidéo a été réalisée en collaboration avec le centre d’Innovation dans l’enseignement et l’apprentissage (CITL) à l’Université Memorial de Terre-Neuve.

1. produits chimiques et des Enzymes purifiées
<ol><li>Se procurer les matériaux suivants : CPD et KGDHC d’origine porcine de coeur (ou un autre flavoenzymes mitochondrial purifié) ; H2O2 (solution à 30 %), le pyruvate, α-cétoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, pyrophosphate de thiamine (TPP), saccharose mannitol, HEPES, EGTA, 3-méthyl-2-oxo-valérique (KMV), superoxyde dismutase (SOD), la peroxydase de raifort (HRP), 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réactif (AUR) et CPI-613.<...

<ol>
	<li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species.">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li><li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forty+years+of+Mitchell's+proton+circuit:+From+little+grey+books+to+little+grey+cells.">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li><li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling.">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li><li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins.">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li><li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2(.-)/H2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue.">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li><li>Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress.">Oxidative Stress.</a> Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).</li><li>Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Progress+in+understanding+the+molecular+oxygen+paradox+-+function+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+cell+signaling.">Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling.</a> Biol Chem. , (2017).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+cellular+energy+transduction+and+its+implications+for+obesity.">The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity.</a> Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).</li><li>Ambrus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+reactive+oxygen+species+by+human+and+bacterial+pyruvate+and+2-oxoglutarate+dehydrogenase+multienzyme+complexes+reconstituted+from+recombinant+components.">Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components.</a> Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase.">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li><li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+superoxide/hydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria.">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li><li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide/hydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex.">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li><li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide/hydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I.">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li><li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase.">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li><li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2(.-)/H2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue.">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li><li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+(E3)+deficiency:+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism.">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li><li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide/hydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria.">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li><li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload.">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li><li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+(complex+I)+from+bovine+heart+mitochondria.">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li><li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart:+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0.">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li><li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase,+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism.">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li></ol>

Ce protocole est avantageux depuis, 1) il élimine toute réactions concurrentes qui peuvent interférer avec la détection de2 H2O (p. ex., systèmes antioxydants ou autres sources de ROS), 2) fournit une évaluation directe de la vitesse native de ROS de sortie par une déshydrogénase mitochondriale flavine, 3) permet la comparaison de l’indigène ROS libérer les taux de deux ou plus purifiée axée sur la flavine déshydrogénases, 4) peut permettre une comparaison directe du taux d?...

Le but ultime du métabolisme des éléments nutritifs est de faire de l’adénosine triphosphate (ATP). Dans les cellules de mammifères, cela se produit dans les mitochondries, organites membrane double qui convertissent l’énergie stockée en carbone en ATP. La production d’ATP commence lorsque le carbone est brûlé par les mitochondries formant deux transporteurs d’électrons, NADH et la flavine adénine dinucléotide (FADH2)1. NADH et FADH2 sont ensuite oxydé par sous-unité multiples complexes respiratoires I et II, respectivement, et les électrons libérés sont transportés à la terminal d’électron accepteur moléculaire l’oxygène (O2) au complexe IV1. Le thermodynamiquement favorable « descente » transfert d’électrons à O2 à la fin de la chaîne est couplé à l’exportation des protons dans l’intermembranaire espace par les complexes I, III et IV. Cela crée un gradient électrochimique transmembranaire de protons (force proton-motrice), une forme temporaire d’énergie libre de Gibbs qui est exploité par complexe V faire ATP2. Réactions de transfert d’électrons dans les mitochondries ne sont pas parfaitement couplées à la production de l’ATP. À divers moments durant le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, les électrons peuvent interagir prématurément avec O2 pour former ROS3. Les ROS plus biologiquement pertinentes générées par les mitochondries sont O2● - et H2O2. O2● - est considéré souvent comme le ROS proximale formées par les mitochondries, il est maintenant évident que les sites de production de forment un mélange de O2● - et H2O2, qui est associé à la libre chimie radicalaire de flavin prothétique regroupe4,5. Des niveaux élevés, ROS peuvent être dangereux, endommageant des constituants biologiques requis pour la fonction cellulaire résultant en détresse oxydante6. Toutefois, à de faibles quantités, ROS mitochondriales remplissent les fonctions vitales de signalisation. Par exemple, H2O2 libération des mitochondries a été impliquée en contrôlant l’activation des lymphocytes T, la contrainte de signalisation (par exemple, l’induction des voies de signalisation Nrf2), l’induction de la prolifération cellulaire et la différenciation, signalisation de l’insuline et libération et alimentation comportement7. Des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la fonction de signalisation de ROS. Cependant, importantes questions demeurent au sujet desquels enzymes dans les mitochondries servent de sources les plus importantes et la façon dont la production est contrôlée.
Communiqué de ROS par un site de production dépend de plusieurs facteurs : 1) la concentration de l’électrodonneur site, 2) l’état d’oxydoréduction du site Don électron, 3) l’accès à l’oxygène et 4) la concentration et le type d’oxydation substrat3, 8 , 9. dans les mitochondries, d’autres facteurs comme la concentration de NADH et membrane force potentielle aussi influer sur la production de ROS8,10. Par exemple, le taux de O2●-/ h2O2 production de purifiée CPD ou KGDHC augmente avec l’augmentation NADH disponibilité5,11. Dans ce scénario, les électrons sont refluer de NADH vers le centre de la FAD dans la sous-unité de3 E du CPD ou KGDHC, le site d’O2●-/ h2O2 production12. De même, la fourniture de NAD+ a l’effet inverse, en diminuant la libération ROS du KGDHC12. Ainsi, contrôle entrée ou sortie des électrons provenant de sites de production de ROS peut altérer combien O2●-/ h2O2 est formé. Par exemple, blocage de la sous-unité de2 E de la CPD ou KGDHC avec un acide lipoïque analogique, diminuent des résultats dans un presque 90 % O2●-/ h2O2 production13, CPI-613. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec le chimique S-glutathionylation catalyseurs, diamide et disulfiram, qui abolir presque O2●/h2O2 production de CPD ou KGDHC par l’intermédiaire de la conjugaison du glutathion au E 2 sous-unités14. Le compromis pour bloquer le flux d’électrons par l’intermédiaire de la sous-unité de2 E de la CPD et KGDHC y a une diminution dans la production de NADH qui diminue la formation de ROS par la chaîne de transport d’électrons (p. ex., complexe III). Cela peut également diminuer la production d’ATP par la chaîne de transport d’électrons. Dans l’ensemble, le fait de bloquer l’entrée des électrons à des sites de production de ROS peut être un moyen très efficace de contrôle de la O2●-/ h2O2 production.
Les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 potentiels O2●-/ h2O2 sources6. La plupart de ces sites sont flavin-contenant des enzymes qui génèrent un mélange d’O2● - et H2O2. Utilisation de différents substrats et carboxypénicillines ont permis l’identification dont complexes respiratoires et déshydrogénases mitochondriales servent de haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites en 3de différents tissus. CPD et KGDHC ont démontré pour servir de grande capacité O2●-/ h2O2 sites émettant dans le muscle et les mitochondries du foie13,15. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne l’examen de l’O2●-/ h2O2 formant des potentiels des sites individuels dans les mitochondries et l’impact ayant différents substrats et carboxypénicillines sur les activités des enzymes. Cela est dû à la présence de réactions secondaires indésirables (p. ex., formation de O2●-/ h2O2 par des sites autres que l’enzyme d’intérêt), contaminant nutriments endogènes (p. ex.,gras les acides) ou organites (p. ex., peroxysomes qui font également O2●-/ h2O2) et l’utilisation d’inhibiteurs que le manque de sélectivité, ou l’utilisation de composés qui n’inhibent pas complètement la production de ROS. Certains inhibiteurs peuvent également altérer la bioénergétique mitochondriale et la direction du flux d’électrons, et cela modifie ROS communiqué provenant d’autres sites de production et confond les résultats. Les taux absolus de O2●/h2O2 libération de sites individuels dans les mitochondries sont également difficiles à quantifier en raison de la forte concentration d’O2● - et H2O2 éliminer les enzymes dans l’espace intermembranaire et de matrice. Par conséquent, élimination de toute réaction concurrente qui peuvent interférer avec l’O2●-/ h2O2 communiqué de mesures peut être utile lorsqu’on veut identifier haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites.
Nous présentons ici une méthode simple qui permet l’examen simultané de O2●-/ h2O2 production et de la formation de NADH par purifiée déshydrogénases flavin-dépendante. À l’aide d’enzymes purifiées, indésirables ROS formant des réactions secondaires et ROS enzymes dégradant peut être éliminé permettant une mesure plus précise des indigènes O2●-/ h2O2 taux de production pour chaque flavoenzymes. Cette méthode peut être utilisée pour comparer directement l’O2●-/ h2O2 formant la capacité des différents déshydrogénases purifiées ou aux inhibiteurs spécifiques au site potentiel écran pour O2●-/ h2O version 2 . Enfin, mesurant O2●-/ h2O2 et la production de NADH en même temps permet une évaluation en temps réel de la relation entre l’activité enzymatique et la capacité de sortie ROS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyruvate dehydrogenase complex</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P7032-10UN</td>
			<td style="width:167px;">purified flavoenzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">K1502-20UN</td>
			<td>purified flavoenzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30% hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">HX0640-5</td>
			<td>reagent, standard curves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD+</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">N0632-1G</td>
			<td>reagent, activity/ROS release assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">N4505-100MG</td>
			<td>reagent, standard curves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P2256-5G</td>
			<td>reagent, activity/ROS release assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">alpha-ketoglutarate</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">75892-25G</td>
			<td>reagent, activity/ROS release assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CoASH</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C3019-25MG</td>
			<td>reagent, activity/ROS release assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C8754-1G</td>
			<td>reagent, activity/ROS release assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mannitol</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M4125-100G</td>
			<td>buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">H3375-25G</td>
			<td>buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">S7903-250G</td>
			<td>buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">E3889-10G</td>
			<td>buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KMV</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">198978-5G</td>
			<td>reagent, ROS release inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CPI-613</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-482709</td>
			<td>reagent, ROS release inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SOD</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">S9697-15KU</td>
			<td>reagent, ROS release detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">horseradish peroxidase</td>
			<td style="width:71px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P8375-1KU</td>
			<td>reagent, ROS release detection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amplex Ultra Red</td>
			<td style="width:71px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">A36006</td>
			<td>reagent, ROS release detection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Biotech Synergy 2 microplate reader</td>
			<td style="width:71px;">BioTek Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>microplate reader for assays</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:71px;">BioTek Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>software, used for collection of raw RFU</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:71px;">Graphpad software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>software, data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft EXCEL</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>software, data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of superoxide/hydrogen peroxide and nadh production by flavin-containing mitochondrial dehydrogenases

Il a été signalé que les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 sources enzymatiques des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Une majorité de ces sites sont complexes respiratoires flavin-dépendante et déshydrogénases qui produisent un mélange de superoxyde (O2● -) et de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Une quantification précise du potentiel ROS-produisant des sites individuels dans les mitochondries isolées peut être difficile en raison de la présence de systèmes de défense antioxydants et les réactions secondaires qui forment aussi O2●-/ h2O2. Utilisation d’inhibiteurs non spécifiques qui peuvent perturber la bioénergétique mitochondriale peut aussi compromettre Mensurations en altérant la libération ROS provenant d’autres sites de production. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure simultanée de la libération de H2O2 et de la production de la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) par purifiée déshydrogénases lié à flavin. Pour nos besoins ici, nous avons utilisé purifiée pyruvate déshydrogénase complexe (CPD) et α-cétoglutarate déshydrogénase complexe (KGDHC) d’origine porcine coeur comme exemples. Cette méthode permet une mesure précise native H2O2 taux de lixiviation par différents sites de production en éliminant les autres sources potentielles des systèmes ROS et antioxydant. En outre, cette méthode permet une comparaison directe de la relation entre la libération de H2O2 et de l’activité enzymatique et de la projection de l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la production de ROS. Dans l’ensemble, cette approche peut permettre l’évaluation approfondie des taux natifs de ROS libération d’enzymes individuelles avant d’effectuer des expériences plus sophistiqués avec des mitochondries isolées ou perméabilisée fibre musculaire.

Figure 3 a prévoit une trace représentante la RFU recueillie pendant la mesure simultanée de la production de NADH et de H2O2 KGDHC purifiée. Les données brutes de RFU pour chaque intervalle de temps sont représentées dans la Figure 3 b. Les données brutes de la RFU sont ensuite exportées pour analyse. En extrapolant à partir des courbes standard présentés dans la Figure 2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases at JoVE.com

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Les mitochondries contiennent plusieurs enzymes de flavin-dépendante qui peuvent produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS). ROS de surveillance communiqué de sites individuels dans les mitochondries est difficile en raison de réactions secondaires indésirables. Nous présentons une méthode simple et peu coûteuse pour une évaluation directe des tarifs natives pour libération ROS en utilisant flavoenzymes purifiée et microplaque fluorométrie.

Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Recherche

Biochimie

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

L&#39;échelle du laboratoire: Production et purification d&#39;un anticorps thérapeutique

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses des Influx de Calcium mitochondrique dans les mitochondries isolées et des cellules

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Haute sensibilité mesure des affinités de liaison de l’ADN-facteur de Transcription par titrage concurrentiel à l’aide de la microscopie en Fluorescence

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...