Name: preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

ونشكر رالف نيلسون ودانيال بوثين لتوجيه مدروس أثناء وضع هذا البروتوكول، وايفا Ma وجورج أشلي ستانتون غيل لتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا مستقرة. وأيده العمل جبهة الخلاص الوطني جرفب 2013158531 للشخص، 5T32EY007031 نيي المعاهد الوطنية للصحة للمراحيض والشخص، و EY026020 إلى J.H. ونشره

ووافقت جامعة واشنطن رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع التجارب على الحيوانات.
1. إعداد الحيوانات والمعدات
ملاحظة: ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ورقة الظلام من الأنسجة المحيطة بالجزء الخارجي الشبكية يمكن أن يحجب ملامح الشبكية التي تصبغ وتلف الأنسجة عند [ك...

<ol>
	<li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Pde6+reduces+cell+body+Ca2++transients+within+photoreceptors.">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li><li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time.">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li><li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0/G1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation.">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception.">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research:+from+tank+to+bedside.">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li><li>Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish.">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li><li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish.">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li><li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans.">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li><li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration.">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li><li>Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina.">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li><li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation.">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).</li><li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li><li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant.">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li><li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments.">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).</li><li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases.">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li><li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Real-time+Glucose+Uptake+Reveals+Distinct+Transport+Among+Cell+Types.">Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).</li><li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2++Pools+in+Cone+Photoreceptors.">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li><li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+by+vital+dyes+of+M&#252;ller+glial+cells+in+retinal+wholemounts.">Selective staining by vital dyes of M&#252;ller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li><li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy.">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , (2012).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina.">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li></ol>

السابقين فيفو تصوير الشرائح الشبكية الزرد الطازجة وقد ثبت أن تكون أداة متعددة الاستخدامات لدراسة علم الأحياء20،،من2122، وهي فريدة من نوعها في ذلك فإنه يمكن تحليل الخلايا المفردة في ناضجة، تماما الشبكية المتباينة. مع الممارسة، من المم...

الزرد (دانيو rerio) أصبحت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الطبية والأساسية1، نظراً لصغر حجمه، والتطور السريع ونظم الجهاز الفقاريات. الشفافية الطبيعية يرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الأساليب المتبعة ترانسجينيسيس مكنت التصور تفصيلية للعمليات الخلوية في الحيوانات حية. استهدفت عددا من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة إلى خلايا محددة الزرد للكشف عن Ca2 + 2، وفوق أكسيد الهيدروجين3، أبوبتوتيك التنشيط4 و ATP5.
في فيفو تصوير يرقات الزرد أدى إلى اختراقات في مجال علم الأعصاب، بما في ذلك رسم خرائط للدماغ الدوائر6 وتطوير العقاقير للجهاز العصبي المركزي واضطرابات7. الزرد أيضا مناسبة للرؤية للبحث نظراً لأن ميزة شبكية العين على بنية طبقية وأنواع الخلايا العصبية للفقاريات العليا، وأنها عرض السلوكيات بصرية قوية8،9. تم بنجاح على غرار عدة أنواع من تنكسات الشبكية مماثلة للأمراض البشرية ودرس في الزرد10،11، بما في ذلك التصوير الحي من photoreceptors حدة التدهور داخل شبكية2، 12.
بينما في فيفو تصوير الزرد اليرقات أداة قيمة، فإنه يصبح أكثر صعوبة كما الأسماك تنمو وتتطور تصبغ، وبعض العلاجات الدوائية لا تتخلل حيوان كامل. علاوة على ذلك، تغيير بعض العمليات الخلوية مع التنمية، والعمر، مما يجعل لاحق الوقت النقاط الحرجة للدالة التفاهم وتطور المرض في الحيوانات الكبار. أساليب الكيمياء الحيوية مثل إيمونوبلوت، كوانتيتياتيفي بكر واستهلاك2 س وتحليلات metabolomic يمكن أن توفر أدلة هامة حول علم الأحياء الشبكية ككل، ولكن من الصعب أن نتبين إسهامات أنواع الخلايا الفردية تتأثر المرض. التصوير نسيج الشبكية معزولة السابقين فيفو يتجاوز هذه القضايا، وحين التصوير شقة المحملة شبكية العين يتيح عرض شبكية العين الخارجي13، يتم حجب ميزات الشبكية الداخلية أعمق. شرائح عرضية الشبكية، مثل تلك التي قدمت في ثابت تحليلات المناعي، تمكين رؤية واضحة لجميع الطبقات وأنواع الخلايا ولكن لا تقدم سوى لقطة واحدة من العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها وظيفة طبيعية والمرض.
نقدم هنا، وسيلة لتوليد السابقين فيفو عرضية الشرائح الشبكية من الزرد الكبار للتصوير. ومشابه لأساليب لإعداد الشرائح الشبكية البرمائية والزرد للدراسات الكهربية والمورفولوجية14،15، مع تعديلات هامة للفاصل الزمني التصوير السابقين فيفو استخدام [كنفوكل] الفحص المجهري. وتراقب الردود الأسفار من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو الصبغات في شرائح في الوقت الحقيقي مع مجهر [كنفوكل] بينما كان يلقي وكلاء الدوائية باستخدام التروية. بينما وضعت الطريقة للتصوير فوتوريسيبتورس، قد يكون من الممكن استخدامها لتصور الخلايا أو الخلايا ثنائية القطب، أفقي من الخلايا، الخلايا أماكريني أو خلايا الشبكية العقدة مولر مع علامات مضيئة مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح مع الفلورية الأصباغ نفاذية الخلية لتقرير جدوى الخلية أو النقل حويصلية، الوظيفة المتقدرية أو حالة الأكسدة والاختزال. يسمح هذا الإعداد تنوعاً تصور طائفة واسعة من العمليات سوبسيلولار في جميع أنحاء الشبكية، بما في ذلك Ca2 + ديناميات وتوصيل الإشارة والدولة الأيضية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1153">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">zebrafish</td>
			<td style="width:239px;">Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:401px;">stocks maintained in-house as stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">petroleum jelly</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">19-090-843</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">3-mL slip tip syringe</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-823-436</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">20g 3.8 cm slip tip needle</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-826-5B</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection, slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Seche Vite clear nail polish</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B00150LT40</td>
			<td style="width:401px;">for slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">18 mm X 18 mm #1 glass coverslips</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">unflavored dental wax</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B01K8WNL5A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">double edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51427</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue slicer with digital micrometer</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51415</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:239px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:181px;">HAWG01300</td>
			<td style="width:401px;">filter paper for mounting retinas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">FB0875712</td>
			<td style="width:401px;">for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">15 cm plain-tipped wood applicator stick</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">23-400-112</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">30g (0.25 mm diameter) tungsten wire</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">AA10408G6</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G8270</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium L-lactate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">L7022</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P2256</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G3126</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;L-glutathione, reduced</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G4251</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">A5960</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S7653</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P9333</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C3881</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S8282</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">M0250</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">BP152</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 N HCl</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">02-003-063</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P5655</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:239px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C1062-P</td>
			<td style="width:401px;">container for Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">501790</td>
			<td style="width:401px;">micro-scissors for eyecup dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">504510</td>
			<td style="width:401px;">fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">single edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-640</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection and trimming filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">EMD Millipore filter forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">XX6200006P</td>
			<td style="width:401px;">flat forceps for handling wet filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">C12 558/568 BODIPY</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">D3835</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 15 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">propidium iodide (PI)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">P3566</td>
			<td style="width:401px;">stains dead cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">62249</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">T668</td>
			<td style="width:401px;">stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue perfusion chamber</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td>
			<td style="width:401px;">imaging chamber for injection or perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:332px;">2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">N13195</td>
			<td style="width:401px;">fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Olympus laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">FV1000</td>
			<td style="width:401px;">confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C2759</td>
			<td style="width:401px;">experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">miniature aspirator positioner</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">FL-1</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder</td>
			<td style="width:239px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:181px;">various</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments

شبكية العين هي نسيج معقد يبدأ ويدمج الخطوات الأولى للرؤية. الخلل الوظيفي للخلايا الشبكية سمة مميزة للكثير من الأمراض المسببة للعمى، والعلاجات المستقبل يتوقف على التفاهمات الأساسية حول كيفية مختلفة الشبكية خلايا تعمل بشكل طبيعي. قد ثبتت صعوبة الحصول على مثل هذه المعلومات مع أساليب الكيمياء الحيوية نظراً لأن هي تناقص المساهمات لأنواع معينة من الخلايا في الوسط الخلية الشبكية. تصوير الشبكية حية يمكن أن توفر طريقة عرض للعديد من العمليات البيولوجية على المستوى سوبسيلولار، بفضل عدد متزايد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة. ومع ذلك، هذه التقنية كانت حتى الآن محدودة للضفادع الصغيرة واليرقات الزرد، طبقات الشبكية الأبعد من شبكية العين المعزولة، أو تصوير القرار أقل من شبكية العين في الحيوانات الحية. هنا نقدم طريقة لتوليد يعيش السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار لتصوير مباشر عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الإعداد غلة شرائح عرضية مع جميع طبقات الشبكية، ومعظم أنواع الخلايا المرئية لأداء تجارب التصوير [كنفوكل] استخدام التروية. إذ تعرب عن بروتينات الفلورسنت الزرد المحورة وراثيا أو أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في أنواع محددة من الخلايا الشبكية أو العضيات تستخدم لاستخراج المعلومات خلية واحدة من شبكية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح الشبكية مع الأصباغ الفلورية المؤشر، إضافة إلى براعة في الأسلوب. تم تطوير هذا البروتوكول للتصوير Ca2 + داخل photoreceptors مخروط الزرد، ولكن بعلامات مناسبة فإنه يمكن تكييفها لقياس Ca2 + أو نواتج الأيض في الخلايا أو الخلايا الأفقية والقطبين، microglia، الخلايا أماكريني أو الشبكية مولر خلايا العقدة. تتم إزالة ظهارة صباغ الشبكية من شرائح حتى هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة هذا النوع من الخلايا. مع الممارسة، من الممكن لإنشاء شرائح المسلسل من الحيوان واحدة لتجارب متعددة. يوفر هذا الأسلوب يمكن تكييفها أداة قوية للرد على العديد من الأسئلة حول بيولوجيا الخلايا الشبكية، Ca2 +والتوازن الطاقة.

مستقرة لتحديد المواقع واتجاه شرائح عرضية هي المفتاح لتصوير ناجحة مع حقن أو نضح من وكلاء الدوائية. بعناية دراسة وتغيير موضع الشرائح قبل تصوير [كنفوكل] حسب الحاجة لضمان جميع طبقات الشبكية هي مرئية (الشكل 2A، شريحة الثاني). إذا كان يتم تدوير شريحة قليلاً إلى ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

رواية ضوء بارادايم ضرر للاستخدام في دراسات التجديد الشبكية في اسماك الزرد الكبار

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

عزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية البالغة عن القشرة الطازجة المجمدة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

المكوك مربع المقايسة كأداة التعلم النقابي للتقييم المعرفي في التعلم ودراسات الذاكرة باستخدام حمار وحشي الكبار

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

تحديد التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في عينات الأنسجة الشبكية Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

محاذاة الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي مع الصور متحدة البؤر لشبكية العين للماوس نفسه

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...