Name: preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

Agradecemos a Ralph Nelson y Daniel Possin orientación reflexiva en el desarrollo de este protocolo y Eva Ma, Ashley George y Gail Stanton para la generación de líneas de pez cebra transgénico estable. El trabajo fue apoyado por NSF GRFP 2013158531 a M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. y M.G. y EY026020 a J.H. y S.B.

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.
1. preparación de animales y equipos
Nota: El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es una hoja oscura de tejido que rodea el exterior de la retina cuya pigmentación puede ocultar características retinianas y daño del tejido cuando confocal ex vivola proyección de imagen. En la oscuridad, el RPE del pez cebra se retrae de la re...

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	<li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Pde6+reduces+cell+body+Ca2++transients+within+photoreceptors.">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li><li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time.">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li><li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0/G1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation.">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception.">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research:+from+tank+to+bedside.">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li><li>Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish.">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li><li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish.">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li><li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans.">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li><li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration.">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li><li>Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina.">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li><li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation.">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).</li><li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li><li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant.">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li><li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments.">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).</li><li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases.">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li><li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Real-time+Glucose+Uptake+Reveals+Distinct+Transport+Among+Cell+Types.">Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).</li><li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2++Pools+in+Cone+Photoreceptors.">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li><li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+by+vital+dyes+of+M&#252;ller+glial+cells+in+retinal+wholemounts.">Selective staining by vital dyes of M&#252;ller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li><li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy.">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , (2012).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina.">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li></ol>

Ex vivo la proyección de imagen de pez cebra frescas rebanadas retiniana ha demostrado para ser una herramienta versátil para el estudio de fotorreceptor biología20,21,22y es el única que permite el análisis de células individuales en una madura totalmente diferenciados retina. Con la práctica, es posible realizar múltiples experimentos con el tejido de un solo pez, incluso usando rebanadas seriales de la misma ...

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en ampliamente utilizado en investigación científica básica y médica1, debido a su tamaño pequeño, rápido desarrollo y sistemas de órganos vertebrados. La transparencia natural de larvas de pez cebra combinado con métodos establecidos para transgénesis han permitido la visualización detallada de los procesos celulares en un animal vivo. Una serie de biosensores fluorescentes genéticamente codificados ha sido blanco específico de pez cebra células para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrógeno3, activación de apoptosis4 y ATP5.
En vivo la proyección de imagen de larvas de pez cebra ha llevado a avances en el campo de las neurociencias, incluida la asignación de cerebro los circuitos6 y7trastornos del desarrollo de medicamentos para el sistema nervioso central. Pez cebra son muy adecuadas para la investigación de visión porque sus retinas la estructura laminar y tipos de neuronas de vertebrados superiores, y muestran comportamientos visual robusto8,9. Varios tipos de degeneraciones retinianas análogas a la enfermedad en humanos han sido modelados con éxito y estudió en el pez cebra10,11, incluyendo proyección de imagen viva de los fotorreceptores individuales degeneren en una retina de2, 12.
Mientras que en vivo imágenes de larvas de pez cebra es una valiosa herramienta, se convierte en más difícil como peces crecen y desarrollan la pigmentación, y algunos tratamientos farmacológicos pueden impregnar un animal entero. Además, ciertos procesos celulares cambian con desarrollo y edad, haciendo más adelante momentos críticos para la función de la comprensión y la progresión de la enfermedad en animales adultos. Métodos bioquímicos como inmunoblot, quantitiative PCR, el consumo de O2 y análisis metabolómicos pueden proporcionar pistas importantes sobre la biología de la retina en su totalidad, pero es difícil distinguir las contribuciones individuales de tipos de células afectadas por de la enfermedad. Imagen tejido retiniano aislado ex vivo pasa por alto estas cuestiones y mientras que la proyección de imagen plana montados retinas ofrece una vista de la retina externa13, características retinianos internos más profundo se oculta. Rebanadas de retina transversal, tales como los presentados en análisis immunohistochemical, permiten una visión clara de todas las capas y tipos de la célula pero nadamas una sola instantánea de los procesos dinámicos implicados en la enfermedad y la función normal.
Aquí, presentamos un método para generar ex vivo transversal rebanadas de retina de pez cebra adulto para la proyección de imagen. Es similar a los métodos para la preparación de rodajas de retina de anfibios y peces cebra para estudios electrofisiológicos y morfológicos14,15, con modificaciones importantes para lapso de tiempo de imagen ex vivo con confocal microscopia. Respuestas de fluorescencia de biosensores o tintes en rodajas son monitoreadas en tiempo real con un microscopio confocal mientras que entregan los agentes farmacológicos mediante perfusión. Mientras que el método fue desarrollado por fotorreceptores la proyección de imagen, puede ser factible utilizar para visualizar las células de Müller, células bipolares, células horizontales, células amacrinas o las células ganglionares de la retina con marcadores fluorescentes apropiados. Además, se pueden cargar rebanadas con tintes fluorescentes permeable a la célula a la viabilidad celular de informe, transporte vesicular, función mitocondrial o estado redox. Esta preparación permite la visualización de una amplia gama de procesos subcelulares a lo largo de la retina, incluyendo dinámicas de Ca2 + , transduction de la señal y estado metabólico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1153">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">zebrafish</td>
			<td style="width:239px;">Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:401px;">stocks maintained in-house as stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">petroleum jelly</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">19-090-843</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">3-mL slip tip syringe</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-823-436</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">20g 3.8 cm slip tip needle</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-826-5B</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection, slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Seche Vite clear nail polish</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B00150LT40</td>
			<td style="width:401px;">for slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">18 mm X 18 mm #1 glass coverslips</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">unflavored dental wax</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B01K8WNL5A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">double edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51427</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue slicer with digital micrometer</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51415</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:239px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:181px;">HAWG01300</td>
			<td style="width:401px;">filter paper for mounting retinas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">FB0875712</td>
			<td style="width:401px;">for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">15 cm plain-tipped wood applicator stick</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">23-400-112</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">30g (0.25 mm diameter) tungsten wire</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">AA10408G6</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G8270</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium L-lactate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">L7022</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P2256</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G3126</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;L-glutathione, reduced</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G4251</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">A5960</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S7653</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P9333</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C3881</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S8282</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">M0250</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">BP152</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 N HCl</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">02-003-063</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P5655</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:239px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C1062-P</td>
			<td style="width:401px;">container for Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">501790</td>
			<td style="width:401px;">micro-scissors for eyecup dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">504510</td>
			<td style="width:401px;">fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">single edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-640</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection and trimming filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">EMD Millipore filter forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">XX6200006P</td>
			<td style="width:401px;">flat forceps for handling wet filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">C12 558/568 BODIPY</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">D3835</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 15 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">propidium iodide (PI)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">P3566</td>
			<td style="width:401px;">stains dead cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">62249</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">T668</td>
			<td style="width:401px;">stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue perfusion chamber</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td>
			<td style="width:401px;">imaging chamber for injection or perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:332px;">2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">N13195</td>
			<td style="width:401px;">fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Olympus laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">FV1000</td>
			<td style="width:401px;">confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C2759</td>
			<td style="width:401px;">experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">miniature aspirator positioner</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">FL-1</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder</td>
			<td style="width:239px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:181px;">various</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments

La retina es un tejido complejo que inicia e integra de los primeros pasos de la visión. Disfunción de células de la retina es una de muchas enfermedades cegadoras y terapias futuras dependen de entendimientos fundamentales sobre cómo diferentes de la retina las células funcionan normalmente. Obtener esa información con métodos bioquímicos ha demostrado ser difícil porque las contribuciones de los tipos de la célula particular se disminuyen en el ambiente de células retinianas. En proyección de imagen retiniana puede proporcionar una vista de los numerosos procesos biológicos a nivel subcelular, gracias a un número creciente de biosensores fluorescentes genéticamente codificados. Sin embargo, esta técnica hasta el momento se ha limitado a los renacuajos y larvas de pez cebra, las capas más externas de la retinales de retinas aisladas, o proyección de imagen de resolución baja de retinas en animales vivos. Aquí presentamos un método para generar vivo ex vivo rebanadas de retina de pez cebra adulto vivo imagen mediante microscopía confocal. Esta preparación rinde rebanadas transversales con todas las capas retinianas y más tipos de células visibles para realizar experimentos de proyección de imagen confocales mediante perfusión. Pez cebra transgénico expresando proteínas fluorescentes o biosensores en tipos de células retinianas específicas u organelos se utilizan para extraer información de unicelular de una retina intacta. Además, rebanadas de retinales se pueden cargar con indicador fluorescente tintes, añadiendo a la versatilidad del método. Este protocolo fue desarrollado para la proyección de imagen Ca2 + en fotorreceptores del cono de pez cebra, pero con los marcadores adecuados podría adaptarse para medir Ca2 + o metabolitos en células de Müller, células bipolares y horizontales, microglia, células amacrinas o retina células del ganglio. El epitelio retiniano del pigmento se retira de rebanadas por lo que este método no es adecuado para el estudio de ese tipo de célula. Con la práctica, es posible generar seriales rebanadas de un animal para experimentos múltiples. Esta técnica adaptable proporciona una poderosa herramienta para responder a muchas preguntas sobre biología celular retiniana, Ca2 +y homeostasis de la energía.

Colocación estable y orientación transversal de rebanadas son clave para la proyección de imagen exitosa con inyección o perfusión de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine y colocar rebanadas antes de la proyección de imagen confocal según sea necesario para asegurar que todas las capas retinianas son visibles (figura 2A, sector ii). Si se hace girar un trozo ligeramente hacia adelante (figura 2A, sector iii), pa...

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Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Investigación

Neurociencias

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparación de Drosophila melanogaster adulto para imágenes cerebrales completas durante las respuestas de comportamiento y estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay como herramienta de aprendizaje asociativo para la evaluación cognitiva en estudios de aprendizaje y memoria utilizando pez cebra adulto

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...