Name: preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

Vi tackar Ralph Nelson och Daniel Possin för vägledning som samtidigt utveckla detta protokoll, och Eva Ma, Ashley George och Gail Stanton för generering av stabil transgena zebrafiskar linjer. Arbetet stöddes av NSF GRFP 2013158531 att M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. och M.G. och EY026020 till J.H. och S.B.

Alla djurförsök godkändes av University of Washington institutionella djur vård och användning kommittén.
1. förbereda djur och utrustning
Obs: Retinal pigmentepitel (RPE) är en mörka blad av vävnaden som omger utsidan av näthinnan vars pigmentering kan skymma retinal funktioner och skada vävnaden när confocal imaging ex vivo. I mörker, är RPE av zebrafisk tillbakadragen från näthinnan; mörka anpassa fisk att underlätta framtida borttagning...

<ol>
	<li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Pde6+reduces+cell+body+Ca2++transients+within+photoreceptors.">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li><li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time.">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li><li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0/G1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation.">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception.">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research:+from+tank+to+bedside.">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li><li>Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish.">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li><li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish.">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li><li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans.">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li><li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration.">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li><li>Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina.">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li><li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation.">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).</li><li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li><li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant.">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li><li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments.">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).</li><li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases.">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li><li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Real-time+Glucose+Uptake+Reveals+Distinct+Transport+Among+Cell+Types.">Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).</li><li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2++Pools+in+Cone+Photoreceptors.">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li><li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+by+vital+dyes+of+M&#252;ller+glial+cells+in+retinal+wholemounts.">Selective staining by vital dyes of M&#252;ller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li><li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy.">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , (2012).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina.">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li></ol>

Ex vivo imaging av färska zebrafiskar retinal skivor har visat sig vara ett mångsidigt verktyg för att studera ljusmätare biologi20,21,22, och är unikt genom att det möjliggör analys av enstaka celler i en mogen, fullt differentierade näthinnan. Med praxis är det möjligt att genomföra flera experiment med vävnad från en enda fisk, även med seriell skivor från samma del av näthinnan. Förutom de utmaninga...

Zebrafiskar (Danio rerio) har blivit allmänt används i medicinska och grundläggande vetenskaplig forskning1, på grund av dess liten storlek, snabb utveckling och ryggradsdjur organsystem. Naturliga insyn i zebrafiskar larver kombinerat med etablerade metoder för genmodifiering har aktiverat detaljerad visualisering av cellulära processer i ett levande djur. Ett antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer har varit riktad till specifika zebrafiskar celler att upptäcka Ca2 + 2, väteperoxid3, apoptotiska aktiveringen4 och ATP5.
In vivo imaging av zebrafisk larver har lett till genombrott inom neurovetenskap, inklusive kartläggning av hjärnans kretsar6 och läkemedelsutveckling för centrala nervsystemet sjukdomar7. Zebrafisk är väl lämpade för vision forskning eftersom deras näthinnor har laminär struktur och neuron typer av högre ryggradsdjur, och de visar robust visuella beteenden8,9. Flera typer av retinal degeneration analogt med mänskliga sjukdomar har modellerad framgångsrikt och studerade zebrafiskar10,11, inklusive levande avbildning av enskilda fotoreceptorer urartar inom en näthinnan2, 12.
I vivo larval zebrafiskar imaging är ett värdefullt verktyg, blir det mer utmanande som fisken växa och utveckla pigmentering, och vissa farmakologiska behandlingar inte kan genomsyra hela djur. Vidare, vissa cellulära processer förändras med utvecklingen och ålder, att göra senare tidpunkter kritiska för förståelse funktion och utvecklingen av sjukdom hos vuxna djur. Biokemiska metoder såsom immunoblot, quantitiative PCR, O2 konsumtion och metabolomiska analyser kan ge viktiga ledtrådar om biologi av näthinnan som helhet, men det är svårt att urskilja bidrag enskilda celltyper som påverkas av sjukdom. Imaging isolerade retinala vävnaden ex vivo kringgår dessa frågor, och medan imaging platt monterade näthinnor ger en vy av den yttersta näthinnan13, djupare inre retinal funktioner döljs. Tvärgående retinal skivor, såsom de presenteras i fast immunhistokemiska analyser, aktivera en klar bild av alla lager och celltyper men bara erbjuda en enda ögonblicksbild av dynamiska processer i normal funktion och sjukdom.
Här presenterar vi en metod för att generera ex vivo tvärgående retinal skivor från vuxna zebrafiskar för avbildning. Det är liknande metoder för att förbereda amfibie och zebrafiskar retinal skivor elektrofysiologiska och morfologiska studier14,15, med viktiga ändringar för tid förfaller imaging ex vivo på confocal mikroskopi. Fluorescens Svaren av biosensorer eller färgämnen i skivor övervakas i realtid med en confocal Mikroskop samtidigt leverera farmakologiska agenter med perfusion. Medan metoden utvecklades för imaging fotoreceptorer, kan det vara praktiskt att använda den för att visualisera Müller celler, bipolära celler, horisontella celler, amakrina celler eller retinala ganglionceller med lämpliga fluorescerande markörer. Dessutom kan skivor laddas med fluorescerande cell-permeable färgämnen till rapporten cellernas viabilitet, vesikulär transport, mitokondriell funktion eller redox staten. Denna mångsidiga förberedelse kan visualisering av ett brett utbud av subcellulär processer i hela näthinnan, inklusive Ca2 + dynamics, signaltransduktion och metabola tillstånd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1153">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">zebrafish</td>
			<td style="width:239px;">Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:401px;">stocks maintained in-house as stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">petroleum jelly</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">19-090-843</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">3-mL slip tip syringe</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-823-436</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">20g 3.8 cm slip tip needle</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-826-5B</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection, slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Seche Vite clear nail polish</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B00150LT40</td>
			<td style="width:401px;">for slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">18 mm X 18 mm #1 glass coverslips</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">unflavored dental wax</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B01K8WNL5A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">double edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51427</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue slicer with digital micrometer</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51415</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:239px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:181px;">HAWG01300</td>
			<td style="width:401px;">filter paper for mounting retinas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">FB0875712</td>
			<td style="width:401px;">for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">15 cm plain-tipped wood applicator stick</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">23-400-112</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">30g (0.25 mm diameter) tungsten wire</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">AA10408G6</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G8270</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium L-lactate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">L7022</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P2256</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G3126</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;L-glutathione, reduced</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G4251</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">A5960</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S7653</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P9333</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C3881</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S8282</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">M0250</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">BP152</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 N HCl</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">02-003-063</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P5655</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:239px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C1062-P</td>
			<td style="width:401px;">container for Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">501790</td>
			<td style="width:401px;">micro-scissors for eyecup dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">504510</td>
			<td style="width:401px;">fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">single edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-640</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection and trimming filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">EMD Millipore filter forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">XX6200006P</td>
			<td style="width:401px;">flat forceps for handling wet filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">C12 558/568 BODIPY</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">D3835</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 15 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">propidium iodide (PI)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">P3566</td>
			<td style="width:401px;">stains dead cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">62249</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">T668</td>
			<td style="width:401px;">stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue perfusion chamber</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td>
			<td style="width:401px;">imaging chamber for injection or perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:332px;">2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">N13195</td>
			<td style="width:401px;">fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Olympus laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">FV1000</td>
			<td style="width:401px;">confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C2759</td>
			<td style="width:401px;">experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">miniature aspirator positioner</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">FL-1</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder</td>
			<td style="width:239px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:181px;">various</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments

Näthinnan är en komplex vävnad som initierar och integrerar de första stegen av vision. Dysfunktion av näthinnans celler är ett kännetecken för många förblindande sjukdomar och framtida terapier gångjärn på grundläggande överenskommelser om hur olika retinala celler fungera normalt. Att få sådan information med biokemiska metoder har visat sig svårt eftersom bidrag särskilt celltyper minskas i näthinnans cell miljö. Levande retinal imaging kan ge en bild av många biologiska processer på en subcellulär nivå, tack vare ett växande antal genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Denna teknik har dock hittills begränsats till grodyngel och zebrafiskar larver, de yttersta retinala lagrarna av isolerade näthinnor, eller lägre upplösning imaging av näthinnor med levande djur. Här presenterar vi en metod för att skapa levande ex vivo retinal skivor från vuxna zebrafiskar för levande imaging via konfokalmikroskopi. Detta preparat ger tvärgående skivor med alla retinala lagren och de flesta celltyper som är synliga för att utföra confocal imaging experiment med perfusion. Transgena Sebrafisken uttrycker fluorescerande proteiner eller biosensorer i specifik retinal celltyper eller organeller används för att extrahera encelliga information från en intakt näthinnan. Dessutom, kan retinal skivor läsas med fluorescerande indikator färgämnen, lägga till metodens mångsidighet. Detta protokoll utvecklades för imaging Ca2 + inom zebrafiskar kon fotoreceptorer, men med ordentlig markörer kan det anpassas för att mäta Ca2 + eller metaboliter i Müller celler, bipolär och horisontella celler, mikroglia, amakrina celler eller retinal ganglionceller. Pigmentepitelet tas bort från skivor så denna metod inte är lämplig för att studera denna celltyp. Med praxis är det möjligt att generera serial skivor från ett djur för flera experiment. Denna anpassningsbar teknik erbjuder ett kraftfullt verktyg för att svara på många frågor om retinal cellbiologi, Ca2 +och energi homeostas.

Stabil positionering och tvärgående orientering av skivor är nyckeln till framgångsrik imaging med injektion eller genomblödning av farmakologiska medel. Noggrant undersöka och flytta skivor före confocal imaging som behövs för att säkerställa alla retinala lagren är synlig (figur 2A, del ii). Om en skiva är roterad framåt något (figur 2A, segment iii), buntar av yttre segment kommer att vara synlig och små juster...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinala vävnaden kan ge encelliga information som inte kan samlas in från traditionella biokemiska metoder. Det här protokollet beskriver beredning av retinal skivor från zebrafisk för confocal imaging. Fluorescerande kodade genetiskt sensorer eller indikator färgämnen tillåta visualisering av många biologiska processer i olika retinala celltyper.

Förbereda färska Retinal skivor från vuxna zebrafiskar för Ex Vivo Imaging experiment

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Märkning av retinal ganglion celler i vuxna zebrafisk med fluorescerande färger

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

A Novel ljusskada Paradigm för användning i Retinal Regeneration Studier i vuxna zebrafisk

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Förbereda vuxen Drosophila melanogaster för hela hjärnan imaging under beteende och Stimuli svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Isolering av vuxna mänskliga astrocytpopulationer från färskfryst cortex med fluorescensaktiverad kärnsortering

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i ex vivo retinal vävnadsprover

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Kalciumavbildning för Drosophila-modell av epilepsi

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...