Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

كان يؤيد هذا العمل بمنحه من وزارة التربية والتعليم الإيطالية وجامعة (2010P3S8BR_002 لحزب المحافظين).

1-بناء المكتبة ORF (الشكل 1)
<ol><li>إعداد إدراج الحمض النووي
	<ol>
<li>
إعداد شظايا من الحمض النووي التركيبية أو الجينوم
		<ol>
<li>استخراج/تنقية الحمض النووي باستخدام الأساليب القياسية26.</li>
			<li>تفتيت الحمض النووي قبل sonication. إذا كان استخدام سونيكاتور قيا?...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

إنشاء مكتبة عالية الجودة التي تمت تصفيتها Orf درجة عالية من التنوع هو الخطوة الأولى الحاسمة في الإجراء برمته نظراً لأنه سوف يؤثر على جميع الخطوات اللاحقة من خط الأنابيب.
سمة هامة مفيدة لأسلوبنا أن أي مصدر للحمض النووي (إينترونلس) (كدنا، الحمض النووي، وبكر مشتقة أو الحمض النوو...

هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للبناء واختيار المكتبات من نطاقات البروتين مطوية وقابل للذوبان من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم. النهج الذي يجمع بين ثلاث تقنيات مختلفة: عرض بالعاثية، واستخدام مراسل قابلة للطي وتسلسل الجيل القادم (خ ع) مع أداة ويب محددة لتحليل البيانات. الأساليب التي يمكن استخدامها في العديد من السياقات المختلفة للبحث القائم على البروتين، لتحديد الهوية والشرح من البروتينات/البروتين من المجالات الجديدة، وتوصيف الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات المعروفة، فضلا عن تعريف شبكة التفاعل البروتين.
العديد من الأسئلة المفتوحة لا تزال موجودة في البحوث القائمة على البروتين وتطوير أساليب لإنتاج البروتين الأمثل ضرورة هامة لعدة مجالات للتحقيق. على سبيل المثال، على الرغم من توافر الآلاف من مورثات بدائية وحقيقية النواة1، خريطة مقابلة من بروتيوميس النسبية مع تعليق توضيحي مباشرة من الببتيدات والبروتينات المكوده مازال مفقوداً للغالبية العظمى من الكائنات الحية. فهرس بروتيوميس كاملة يبرز بوصفه هدفا صعبة التي تتطلب جهدا ضخما من حيث الوقت والموارد. يبقى المعيار الذهبي للشرح التجريبية استنساخ جميع "المفتوحة قراءة الإطارات" (Orf) الجينوم، بناء ما يسمى "أورفيومي". عادة ما يتم تعيين وظيفة الجينات استناداً إلى التماثل للجينات المتصلة النشاط المعروفة ولكن هذا النهج دقيقة ضعيفة بسبب وجود العديد من الشروح غير صحيحة في مرجع قواعد البيانات2،،من34، 5. وعلاوة على ذلك، حتى بالنسبة للبروتينات التي تم تحديدها والمشروح، دراسات إضافية مطلوبة لتحقيق الوصف من حيث الوفرة، وأنماط التعبير في السياقات المختلفة، بما في ذلك الخصائص الهيكلية والوظيفية، وكذلك شبكات التفاعل.
وعلاوة على ذلك، نظراً للبروتينات تتألف من نطاقات مختلفة، كل منها عرض ميزات محددة، والإسهام بشكل مختلف وظائف البروتين، الدراسة والتعريف الدقيق لهذه المجالات يمكن أن تسمح صورة أكثر شمولاً، كلاهما في الواحد الجينات والجينوم الكامل على الصعيد. كل هذه المعلومات ضرورية يجعل البحث القائم على البروتين حقلاً واسعاً وتحديا.
من هذا المنظور، يمكن إعطاء مساهمة هامة بأساليب غير متحيزة والفائق لإنتاج البروتين. بيد أن نجاح هذا النهج، إلى جانب الاستثمارات الكبيرة المطلوبة، يعتمد على القدرة على إنتاج البروتين للذوبان/مستقرة بنيات. وهذا يشكل الحد من عامل نظراً لأنها قدرت أن فقط حوالي 30% بروتينات يمكن أن أعرب بنجاح وأنتجت على مستويات كافية لتكون مفيدة تجريبيا6،،من78. ويستند نهج للتغلب على هذا القيد استخدام الحمض النووي مجزأة عشوائياً لإنتاج البروتينية المختلفة، التي توفر معا متداخلة تمثيل جزء من الجينات الفردية. نسبة صغيرة فقط من أجزاء الحمض النووي تم إنشاؤه عشوائياً هي Orf الفنية بينما الغالبية العظمى منهم غير وظيفية (بسبب وجود stop codons داخل تسلسل بهم) أو ترميز للأمم المتحدة الطبيعية (ORF في إطار خلاف الأصلي) البروتينية مع لا معنى البيولوجية.
لمعالجة جميع هذه القضايا، وضعت مجموعتنا بروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل منصة التي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم9،10،،من1112. هذا البرنامج يدمج التقنيات التالية: 1) طريقة تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي من أي كائن حي؛ 2) بالعاثية عرض التكنولوجيا لتحديد شركاء تفاعلات؛ 3 خ ع) تماما تميز إينتيراكتومي كلها قيد الدراسة وتحديد المستنسخين الاهتمام؛ و 4) أداة ويب لتحليل البيانات للمستخدمين دون الحاجة إلى مهارات البرمجة أو المعلوماتية الحيوية لإجراء تحليل Seq إينتيراكتومي بطريقة سهلة وسهلة الاستعمال.
استخدام هذا البرنامج يوفر مزايا هامة أكثر استراتيجيات بديلة للتحقيق؛ قبل كل شيء الأسلوب تماما غير متحيزة والفائق، ووحدات للدراسة تتراوح بين مورثة واحدة تصل إلى جينوم كله. الخطوة الأولى من خط الأنابيب هو إنشاء مكتبة من الحمض النووي عشوائياً مجزأة تحت الدراسة، ثم تميزت خ ع عميق. يتم إنشاء هذه المكتبة باستخدام المتجهات هندسيا حيث يتم استنساخ الجينات/شظايا اهتمام بين تسلسل إشارة لإفراز البروتين في الفضاء بيريبلاسميك (أي، زعيم ثانية) والجين β-lactamase TEM1. سوف تمنح البروتين الانصهار الأمبيسلّين المقاومة والقدرة على البقاء على قيد الحياة تحت ضغط الأمبيسلّين إلا إذا كانت الشظايا المستنسخة في الإطار مع كل من هذه العناصر والبروتين الانصهار الناتج هو مطوية بشكل صحيح10،13 ،14. جميع النسخ إنقاذهم بعد اختيار المضادات الحيوية، ما يسمى "استنساخ تصفيته"، Orf، وغالبية العظمى منهم (أكثر من 80 في المائة)، مستمدة من الجينات الحقيقية9. علاوة على ذلك، تكمن قوة هذه الاستراتيجية في النتائج أن جميع الحيوانات المستنسخة ORF تصفيتها يتم ترميز للبروتينات بشكل صحيح مطوية/الذوبان/المجالات15. كما لدى الكثير من استنساخ، موجودة في المكتبة ورسم الخرائط ذات الصلة في نفس المنطقة/المجال، مختلفة في البداية والنهاية نقطة، يسمح هذا تحديد غير منحازة، وخطوة واحدة من الشظايا الدنيا التي من المحتمل أن يؤدي إلى منتجات قابلة للذوبان.
ويرد مزيد من تحسن في التكنولوجيا باستخدام خ ع تميز المكتبة. المزيج من هذه المنصة، وأداة ويب محددة لتحليل البيانات يعطي معلومات هامة غير منحازة على تسلسل النوكليوتيدات الدقيق وعلى موقع Orf المحدد على مرجع الحمض النووي قيد الدراسة دون الحاجة إلى المزيد من التحليلات الواسعة أو الجهد التجريبي.
ويمكن نقلها في سياق تحديد مكتبات دومينومي وتستخدم كأداة عالمية لإجراء الدراسات الفنية. البروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل المنهاج أن نحن متكاملة وأن طالبنا Seq إينتيراكتومي يستفيد من تكنولوجيا العرض بالعاثية بتحويل ORF المصفاة إلى ناقل فاجيميد وخلق بالعاثية-ORF مكتبة. إعادة استنساخ مرة واحدة في سياق عرض بالعاثية، بروتين مجالات يتم عرضها على سطح جسيمات M13؛ وبهذه الطريقة يمكن تحديد مكتبات دومينومي مباشرة للشظايا الجينات ترميز المجالات مع الأنشطة الانزيمية محددة أو ربط خصائص، يسمح للشبكات إينتيراكتومي التنميط. وقد وصف هذا النهج في البداية زاكتشي et al. 16 واستخدمت فيما بعد في عدة أخرى السياق13،،من1718.
بالمقارنة مع غيرها من التكنولوجيات المستخدمة لدراسة التفاعل البروتين-بروتين (بما في ذلك نظام هجين اثنين الخميرة والطيف الكتلي19،20)، ميزة رئيسية واحدة هي التضخيم الشريك الملزم الذي يحدث أثناء بالعاثية عرض جولات متعددة من التحديد. وهذا يزيد من حساسية الاختيار مما يسمح بتحديد المجالات ملزم وفيرة منخفضة البروتينات الموجودة في المكتبة. هو زيادة كفاءة اختيار المنفذ مع ارف تصفية مكتبة بسبب غياب استنساخ غير وظيفية. أخيرا، تسمح هذه التقنية التحديد التي يتعين القيام بها ضد كل من البروتين والبروتين غير الطعم21،،من2223،24،25.
بالعاثية التحديدات باستخدام مكتبة دومينومي-بالعاثية يمكن أن يؤديها باستخدام الأجسام المضادة قادمة من الأمصال للمرضى الذين يعانون من الحالات المرضية المختلفة، مثل أمراض المناعة الذاتية13أو السرطان أو العدوى من الأمراض كطعم. يتم استخدام هذا النهج للحصول على ما يسمى "جسم التوقيع" هذا المرض قيد الدراسة مما يسمح على نطاق واسع في تحديد وتوصيف المستضدات/[ابيتوبس] تعترف على وجه التحديد بأجسام المرضى في نفس الوقت. مقارنة بالأساليب الأخرى الاستخدام بالعاثية يسمح العرض تحديد [ابيتوبس] مستضدي الخطي وكونفورماشونال على حد سواء. تحديد توقيع محدد يمكن أن يكون لها تأثير هام لفهم الآلية المرضية، وتصميم لقاح جديد، تحديد أهداف علاجية جديدة واستحداث أدوات تشخيصية وتشخيصية جديدة ومحددة. وعلاوة على ذلك، عند الدراسة تركز على الأمراض المعدية، ميزة كبيرة أن اكتشاف البروتينات مكسبه ومستقلة عن زراعة الممرض.
نهجنا ويؤكد أن الصحفيين قابلة للطي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم لتحديد "دومينومي": عبارة عن مجموعة من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح، وكذلك أعرب، القابلة للذوبان من ترميز جزء من الحمض النووي و/أو كدنا من أي كائن حي. مرة معزولة شظايا البروتين مفيدة لأغراض كثيرة، توفير معلومات تجريبية أساسية للشرح الجينات، وكذلك فيما يتعلق بالدراسات الهيكلية، جسم حانمه رسم الخرائط، مستضد تحديد الهوية، إلخ. اكتمال البيانات الفائق المقدمة من خ ع يتيح تحليل العينات معقدة للغاية، مثل بالعاثية عرض المكتبات، ويحمل إمكانات للتحايل على الانتقاء شاقة التقليدية واختبار فردية بالعاثية إنقاذ الحيوانات المستنسخة.
في الوقت نفسه بفضل ميزات المكتبة التي تمت تصفيتها والحساسية المفرطة والقوة لتحليل خ ع، فمن الممكن لتحديد المجال البروتين مسؤولة كل التفاعل مباشرة شاشة أولى، دون الحاجة إلى إنشاء مكتبات إضافية لكل ملزمة البروتين. خ ع يتيح الحصول على تعريف شامل دومينومي كله من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم وأداة ويب تحليل البيانات يمكن الحصول على توصيف محددة للغاية كلا من نوعية وكمية من وجهة نظر المجالات للبروتينات إينتيراكتومي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

الصحفيين للطي هي بروتينات مع تعمل يمكن تحديدها بسهولة، مثل مقاومة المضادات الحيوية، الذي قابلة للطي والدالة للخطر عندما تنصهر فيها سيئة لطي البروتينات أو إطارات عشوائية القراءة المفتوحة. قمنا بتطوير استراتيجية فيها، باستخدام ال-1 β-lactamase (الإنزيم منح المقاومة الأمبيسلّين) على نطاق الجينوم، علينا تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي لأي الجينوم إينترونلس. سوف تكون الشظايا البروتين التي حصل عليها هذا النهج، ما يسمى "دومينومي"، كذلك أعرب عنه وقابل للذوبان، يجعلها مناسبة للدراسات الهيكلية/الوظيفية.
عن طريق الاستنساخ، وعرض "دوماينومي" مباشرة في نظام عرض بالعاثية، لقد أظهرنا أنه من الممكن لتحديد مجالات محددة من البروتين مع خصائص الربط المطلوبة (مثلاً، إلى غيرها من البروتينات أو الأجسام المضادة)، وبالتالي توفير أساسي المعلومات التجريبية لتحديد الجينات الشرح أو مستضد.
يمكن تحديد المستنسخين المخصب الأكثر في عدد سكان [بولكلونل] محدد باستخدام تقنيات رواية الجيل التالي التسلسل (خ ع). لهذه الأسباب، فنحن نقدم تحليل تسلسل عميق المكتبة نفسها والنواتج التحديد تقديم معلومات كاملة عن التنوع والوفرة ورسم خرائط دقيقة لكل من الجزء المحدد. وتظهر البروتوكولات المقدمة هنا الخطوات الرئيسية لبناء المكتبة، وتوصيف، والتحقق من الصحة.

أن النهج التصفية هي المخططة في الشكل 1. ويمكن استخدام كل نوع من الحمض النووي إينترونلس. في الشكل 1 (أ) يمثل الجزء الأول من نهج تصفية: بعد التحميل [اغروس] هلام أو بيواناليزير، يظهر تجزئة جيدة من الحمض النووي للفائدة كمسحة من الشظايا بتوزيع طول ...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

تسمح البروتوكولات وصف البناء والتوصيف والتحديد (مقابل الهدف المفضل) من مكتبة "دوماينومي" من أي مصدر الحمض النووي. يتحقق ذلك من خلال خط أنابيب بحث الذي يجمع بين التكنولوجيات المختلفة: عرض بالعاثية، مراسل للطي وتسلسل الجيل القادم مع أداة ويب لتحليل البيانات.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الأبحاث القائمة على البروتين مثل شرح البروتينات الجديدة أو مجالات البروتين ، وتوصيف الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات المعروفة ، تعريف شبكات التفاعل البروتينية أو توقيعات الأجسام المضادة المضادة في ظروف مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير متحيزة تمامًا وعالية الإنتاجية ووحدات لأي نوع من الدراسة تتراوح بين جين واحد إلى جينوم كامل. بناء مكتبة domainone مفيد جدا للدراسات الوظيفية.ويمكن نقلها إلى سياق عرض phage واستخدامها للاختيار ضد أهداف مختلفة مثل البروتينات ملزمة أو الأجسام المضادة النقية. إن اقترانه مع الـ NGS يتيح تحليلاً بالغ الحساسية والقوي. في الوقت نفسه ، فإن أدوات الويب التي تم تطويرها على وجه التحديد تعطي توصيفًا دقيقًا للنطاق بأكمله و interactome.لبناء مكتبة ORF أولاً، sonicate الحمض النووي مع 30 ثانية نبضات في 100٪ الإخراج. بعد سونيكيشن، تحميل سلم والحمض النووي سونيكاتيد على 1.5٪ agarose هلام. ثم ابدأ وحدة الكهرباء في خمسة فولت لكل سنتيمتر لمدة 15 دقيقة.وكهربية جل agarose يظهر وجود مسحة الحمض النووي تؤكد سونيكيشن. هذا بالمقارنة مع الفرقة الصلبة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي لا تخضع ل sonication. ثم قطع جزء هلام مع تشويه الحمض النووي مسحة وتنقية باستخدام عمود أساس هلام استخراج عدة.قياس تركيز الحمض النووي المنقى في مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ثم اتبع تعليمات الشركة المصنعة وعلاج خمسة ميكروجرام من إدراج مع ميكرولتر واحد من مزيج انزيم سريع الفظ. ثم تعطيل مزيج انزيم في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.لإعداد متجه التصفية، هضم أولاً خمسة ميكروغرامات من متجه الاستنساخ المنقى مع إنزيم تقييد EcoRV. ثم تحميل ناقلات هضمها وغير مهضومة وعلامة الجزيئية على 1٪ agarose هلام. ثم الحرارة تعطيل إنزيم تقييد في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.بعد ذلك، phosphorylate ناقلات هضم مع خمس وحدات من إنزيم الفوسفاتاتيز و 1/10 حجم من 10X فوسفاتاتيز العازلة. ثم احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم تعطيل إنزيم فوسفاتاز في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، استخراج البلازميد من هلام وتنقية الحمض النووي. ثم قياس تركيز الحمض النووي في مطياف الأشعة فوق البنفسجية. لتنفيذ تفاعل الربط، أضف 400 نانوجرام من إدراج الفوسفوريلي إلى ميكروغرام واحد من المتجه المهضم، ومخزن 10X T4 للأربطة الحمض النووي و T4 الحمض النووي للرابطة إلى حجم نهائي من 100 ميكرولترات.ثم احتضان رد فعل الربط في 16 درجة مئوية لليلة واحدة. في اليوم التالي، ابطل الحرارة الرباط عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 1/10 حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في 5.2 و 2.5 وحدات تخزين من الإيثانول 100٪ لتعجيل المنتج الربط.لتعجيل الحمض النووي، مزيج الكواشف وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة، الطرد المركزي في أعلى سرعة لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، طرد الماحتَر.إلى بيليه، إضافة 500 ميكرولترات من الإيثانول البارد 70٪ والطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل المغرور في نهاية الطرد المركزي. مرة واحدة في بيليه هو الهواء المجفف، حل الحمض النووي عجل في 10 ميكرولترات من الماء.قبل إجراء كهربية، ترتيب العدد المناسب من أنابيب microcentsrifuge و 0.1 سنتيمتر الكتروبورات الكهربائية على الجليد. ثم إضافة ميكرولتر واحد من المنتج الربط النقي إلى 25 ميكرولترات من الخلايا. ثم الماصات الحمض النووي، وخلية خليط إلى cuvette الكهربائي الباردة ونفض الغبار الأنبوب.ثم امسح الماء من الخارج من cuvette ووضعها في وحدة الكهرباء وضرب النبض. بعد أن يكون الكهربائي قد انتهى ، بسرعة إضافة ملليلتر واحد من السائل 2X YT المتوسطة دون أي مضاد حيوي للخلايا في cuvette. ثم نقل الخليط الخلوي إلى أنبوب 10 ملليلتر.ترك أنبوب على شاكر في 220 الثورات في الدقيقة الواحدة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة. لوحة التخفيفات من المكتبة على 10 سم 2X YT أجار لوحات تكملها الكلورافينيكول، أمبيسيلين والكلورافينيكول فقط. وهذا هو الحصول على مستعمرات واحدة لاختبارها بواسطة PCR وإجراء المعايرة.المقبل، لوحة الخلايا المختصة المحولة على 15 سم 2X YT لوحات أغار تكملها الكلورافينيكول و أمبيسيلين. ثم احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لليلة واحدة. في اليوم التالي، عد المستعمرات اختيار التخفيف حيث أنها قابلة للعد.ثم حساب حجم المكتبة. يتم حساب حجم المكتبة على النحو التالي، متوسط عدد مستعمرة مرات عامل التخفيف مرات إجمالي حجم المكتبة. وينبغي أن يكون حجم المكتبة في ترتيب 10 إلى قوة ستة مستنسخين.إذا كان تركيز الأمبيسيلين هو الأمثل لأداء المزيد من التصفية، وعدد استنساخ يقلل إلى واحد إلى 20 من التي تم الحصول عليها في غياب هذا المضاد الحيوي. لاختبار للمستعمرات الإيجابية، استخدم نصيحة لالتقاط حوالي 15 إلى 20 مستعمرة واحدة. ثم تمييع المستعمرات مع 100 ميكرولترات من 2X YT المتوسطة دون المضادات الحيوية.بعد ذلك ، تضخيم PCR 0.5 ميكرولتر من الثقافة كقالب الحمض النووي مع بوليميراز الحمض النووي Taq. أثناء PCR، تشغيل 25 دورات من التضخيم باستخدام درجة حرارة الصلب من 55 درجة مئوية وتمديد الوقت من 40 ثانية في 72 درجة مئوية. تحقق من أن طول الإدراج في النطاق المتوقع من 150 إلى 750 زوج قاعدة.وأنّ مستعمرات مختلفة يقدّم إدراج مختلفة مع حجم مختلفة. وهذا يشير إلى إعداد مكتبة جيدة من حيث التغير. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من 2X YT المتوسطة الطازجة إلى لوحات 150 ملليمتر لجمع البكتيريا.ثم حصاد البكتيريا باستخدام مكشطة معقمة. بعد خلط جيدا، إضافة 20٪ الجلسرين وترك في ناقص 80 درجة مئوية في aliquots للاستخدام في المستقبل. للاستخدام الفوري، تنفيذ عمود أساس طقم استخراج plasmid لتنقية الحمض النووي plasmid من واحدة من aliquots من المكتبة قبل إضافة الجلسرين.قياس تركيز الحمض النووي في مطياف الأشعة فوق البنفسجية ومن ثم تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدام 2.5 ميكرولترات من المكتبة كقالب الحمض النووي لتضخيم PCR. تعيين ظروف الدراجات الحرارية وبدء تشغيل.بعد ذلك، استخدم مجموعة PCR فهرس لتنفيذ فهرس PCR. هذا سوف تسلسل المكتبات المفهرسة المزدوجة داخل تشغيل Multixed Illumina. ثم تعيين ظروف thermocycler وبدء تشغيل.بعد تنقية مع الخرز XP AMPure، للتحقق من حجم، تشغيل ميكرولتر واحد من واحد إلى 10 تخفيف المكتبة النهائية على bioanalyzer. ثم تحديد كمي عن طريق اختيار المنطقة من تتبع المكتبة النهائية. هذه التمثيلات التخطيطية demonstate أنه بعد الاستنساخ في P مرشح ناقلات، فقط المستعمرات المقابلة لORFs تنتج وظيفية بيتا lactamase في وجود المضادات الحيوية.بعد تصفية انخفاض في عدد استنساخ من 20 من المتوقع أضعاف. مع ORFs جيدة المجلد تنمو في تركيزات أعلى المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة استرداد أجزاء ORF من المكتبة المصفاة.تم بناء مكتبة فيجميد ORF لأداء اختيار عرض phage ضد البروتينات المستهدفة أو الأجسام المضادة. ثم يتم تحليل جميع المكتبات والمخرجات التي تم الحصول عليها بعمق من قبل NGS. وتوفر هذه القوائم معلومات كاملة عن تنوع المكتبات، ووفرة كل جزء من الأجزاء المختارة، ورسم خرائط دقيقة لها.وأخيراً، فإن أداة البحث interactome التي تم تطويرها تولد قراءات تسلسلية أولية تتراوح إلى قائمة المجالات المفترضة مع الشروح الجينومية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء مكتبة domainome والتحقق من صحتها من مصدر الحمض النووي المطلوب. وإجراء فحص عالي الإنتاجية للمكتبة من خلال تسلسل الجيل القادم.لقد قمنا بتحسين تسلسل مكتبات تصفية ORF مع منصات Illumina ووضعنا أداة ويب تجعل من الممكن تحليل هذا النوع من البيانات دون الحاجة إلى مهارات البرمجة.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3 ' نهاية تسلسل إعداد مكتبة مع A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...