Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra italienske Undervisningsministeriet og universitetet (2010P3S8BR_002 til CP).

1. opførelse af ORF bibliotek (figur 1)
<ol><li>Forberedelse af Indsæt DNA
	<ol>
<li>
Fragmenter forberedelse fra syntetisk eller genomisk DNA
		<ol>
<li>Uddrag/rense DNA ved hjælp af standard metoder26.</li>
			<li>Fragment DNA ved hjælp af sonikering. Hvis ved hjælp af en standard sonikator, som en generel henstilling start med 30 s pulser på 100% power output. Bemærk: Pilot forsøg bør gøres med forskellige power og s...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Oprettelsen af en høj kvalitet meget forskelligartede ORFs filtreret bibliotek er det første vigtige skridt i hele proceduren, da det vil påvirke alle de efterfølgende trin i rørledningen.
Et vigtigt fordelagtige element i vores metode er, at enhver kilde (intronless) DNA (cDNA, genomisk DNA, PCR afledt eller syntetiske DNA) er egnet til biblioteket konstruktion. Den første parameter, der bør tages i betragtning er, at længden af DNA fragmenterne klonet i pFILTER vektor bør give en re...

Her, beskriver vi en høj overførselshastighed metode for byggeri og udvælgelse af biblioteker af foldede og opløseligt protein domæner fra enhver genic/genomisk start kilde. Metoden kombinerer tre forskellige teknologier: phage display, brug af folde reporter og næste generation sequencing (NGS) med en bestemt web-værktøj til dataanalyse. Metoderne, der kan bruges i mange forskellige sammenhænge af protein-baseret forskning, til identifikation og anmærkning af nye proteiner/protein domæner, karakterisering af strukturelle og funktionelle egenskaber af kendte proteiner samt definitionen af protein-interaktion netværk.
Mange åbne spørgsmål er stadig til stede i protein-baseret forskning og udvikling af metoder til optimal protein produktion er et vigtigt behov for flere områder af undersøgelsen. For eksempel, på trods af tilgængeligheden af tusindvis af prokaryote og eukaryote genomer1er en tilsvarende kort over den relative proteomes med en direkte kommentering af kodede proteiner og peptider stadig mangler for de fleste organismer. Katalog af komplet proteomes fremstår som et udfordrende mål, der kræver en stor indsats med hensyn til tid og ressourcer. Guldstandarden for eksperimenterende anmærkningen forbliver kloning af alle de åbne læserammer (ORFs) af en genom, opbygning af den såkaldte "ORFeome". Genfunktion tildeles normalt baseret på homologi relaterede gener kendt aktivitet, men denne fremgangsmåde er dårligt præcis på grund af tilstedeværelsen af mange forkerte anmærkninger i reference databaser2,3,4, 5. Desuden, selv for proteiner, der er blevet identificeret og kommenteret, yderligere undersøgelser er nødvendige at opnå karakterisering med hensyn til overflod, udtryk mønstre i forskellige sammenhænge, herunder strukturelle og funktionelle egenskaber som interaktion netværk.
Desuden, da proteiner er sammensat af forskellige domæner, hver af dem viser specifikke funktioner og anderledes bidrager til protein funktioner, undersøgelsen og den nøjagtige definition af disse domæner kan tillade en mere omfattende billede, både på indre gen og i fuld genom. Alle disse nødvendige oplysninger gør protein-baseret forskning en bred og udfordrende område.
I dette perspektiv er kunne et vigtigt bidrag gives af uvildige og høj overførselshastighed metoder til protein produktion. Men succesen af sådanne fremgangsmåder, ved siden af de betydelige investeringer, bygger på evnen til at producere opløselige/stabil protein konstruktioner. Dette er en stor begrænsende faktor, da det er blevet anslået, at kun omkring 30% af proteiner kan udtrykkes med succes og produceret på et tilstrækkeligt niveau være eksperimentelt nyttige6,7,8. En metode til at overvinde denne begrænsning er baseret på brugen af tilfældigt fragmenterede DNA til at producere forskellige polypeptider, som tilsammen udgør overlappende fragment repræsentation af enkelte gener. Kun en lille procentdel af tilfældigt genererede DNA fragmenter er funktionelle ORFs, mens det store flertal af dem er ikke-funktionelle (på grund af tilstedeværelsen af stop kodon inde deres sekvenser) eller indkode for un-naturlige (ORF i en ramme end oprindelige) polypeptider med ingen biologiske betydning.
For at løse alle disse problemer, har vores gruppe udviklet en høj overførselshastighed protein udtryk og interaktion analyse platform, der kan bruges på en genomisk skala9,10,11,12. Denne platform integrerer de følgende teknikker: 1) en metode til at vælge samlinger af korrekt foldet protein domæner fra den kodende del af DNA fra enhver organisme; 2) phage display-teknologi til at vælge partnere af interaktioner; 3) NGS helt karakterisere den hele interactome under undersøgelse og identificere kloner af interesse; og 4) en web-værktøj til analyse af data for brugere uden Bioinformatik eller programmering færdigheder til at udføre Interactome-Seq analyse på en nem og brugervenlig måde.
Brugen af denne platform tilbyder vigtige fordele i forhold til alternative strategier af undersøgelsen; først og fremmest er metoden helt objektiv, høj overførselshastighed og modulære for undersøgelse spænder fra et enkelt gen op til en samlede genom. Det første trin af rørledningen er oprettelsen af et bibliotek fra tilfældigt fragmenterede DNA under undersøgelsen, som er så dybt præget af NGS. Dette bibliotek er genereret ved hjælp af en manipuleret vektor hvor gener/fragmenter af interesse er klonet mellem et signal sekvensen for protein sekretion i periplasmic plads (dvs., Sec førende) og TEM1 β-lactamase-gen. Fusion protein vil tillægge ampicillin-resistens og evnen til at overleve under ampicillin pres kun hvis klonede fragmenter er i-frame med både disse elementer og den heraf følgende fusion protein er korrekt foldet10,13 ,14. Alle kloner reddet efter antibiotika valg, den såkaldte "filtreret kloner", er ORFs og et stort flertal af dem (mere end 80%), stammer fra virkelige gener9. Desuden ligger kraften i denne strategi i de resultater, at alle ORF filtreret kloner kodning for korrekt foldet/opløselige proteiner/domæner15. Som mange kloner, findes i den bibliotek og kortlægning i den samme region/domæne, har forskellige udgangspunkt og slutpunkt, giver dette uvildig, trinvis identifikation af minimum fragmenter, der er tilbøjelige til at resultere i opløselige produkter.
En yderligere forbedring af teknologien, der er givet ved brug af NGS at karakterisere biblioteket. Kombinationen af denne platform og af en bestemt web-værktøj til analyse af data giver vigtige upartiske oplysninger om de nøjagtige nukleotidsekvenser og placeringen af udvalgte ORFs på reference DNA under undersøgelsen uden behov for yderligere omfattende analyser eller eksperimentelle forsøg.
Domainome biblioteker kan overføres til et udvalg sammenhæng og anvendes som et universelt instrument til at udføre funktionelle studier. Høj overførselshastighed protein udtryk og interaktion analyse platformen, vi integreret, og som vi kaldte Interactome-Seq udnytter phage display teknologi ved at overføre de filtrerede ORF i en phagemid vektor og skabe en phage-ORF bibliotek. En gang igen klonet i forbindelse phage display, protein domæner vises på overfladen af M13 partikler; på denne måde kan domainome biblioteker vælges direkte for gen fragmenter kodning domæner med specifikke enzymaktiviteter eller bindende egenskaber, så interactome netværk profilering. Denne tilgang blev først beskrevet af Zacchi et al. 16 og senere brugt i flere andre sammenhæng13,17,18.
Sammenlignet med andre teknologier, der anvendes til at undersøge protein-protein interaktion (herunder gær to hybridsystem og massespektrometri19,20), er en stor fordel forstærkning af den bindende partner, der opstår under phage vise flere runder af udvalg. Dette øger udvalg følsomheden således identifikation af lav rigelige bindende proteiner domæner i biblioteket. Effektiviteten af valget udført med ORF-filtreret bibliotek er yderligere steget på grund af manglen på ikke-funktionelle kloner. Endelig tillader teknologien udvalg skal udføres mod både protein og ikke-protein lokkemad21,22,23,24,25.
Phage valg ved hjælp af domainome-phage biblioteket kan udføres ved hjælp af antistoffer kommer fra sera af patienter med forskellige patologiske tilstande, fx autoimmune sygdomme13, kræft eller infektion sygdomme som madding. Denne fremgangsmåde anvendes til at opnå den såkaldte "antistof signatur" af sygdom under undersøgelsen gør det muligt at massivt identificere og karakterisere antigener/epitoper specifikt anerkendt af patienternes antistoffer på samme tid. Sammenlignet med andre metoder til brug af phage display giver mulighed for identifikation af både lineære og konformationelle antigene epitoper. Identifikation af en bestemt signatur kunne potentielt har stor betydning for forståelse patogenese, ny vaccine design, identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye og specifikke diagnostiske og prognostiske værktøjer. Desuden, når undersøgelsen er fokuseret på smitsomme sygdomme, en stor fordel er, at opdagelsen af immunogen proteiner er uafhængig af patogenet dyrkning.
Vores tilgang bekræfter at folde journalister kan bruges på en genomisk skala for at vælge "domainome": en samling af korrekt foldet, godt udtryk, opløseligt protein domæner fra den kodende del af DNA og/eller cDNA fra enhver organisme. En gang isolerede protein fragmenter er nyttige til mange formål, vigtige eksperimentelle oplysning til gen anmærkning samt med hensyn til strukturelle studier, antistof epitop kortlægning, antigen identifikation, osv. Fuldstændigheden af høj overførselshastighed data fra NGS muliggør analysen af meget komplekse prøver, såsom phage display biblioteker, og rummer potentiale til at omgå den traditionelle møjsommeligt picking og testning af individuelle phage reddet kloner.
På samme tid takket være funktioner af filtrerede biblioteket og til den ekstreme følsomhed og kraft af NGS analyse er det muligt at identificere det protein domæne ansvarlig for hver interaktion direkte i en indledende skærm, uden at skulle oprette ekstra biblioteker for hver bundet protein. NGS giver mulighed for at opnå en omfattende definition af den hele domainome af enhver genic/genomisk start kilde og data analyse web tool muliggør opnåelse af en meget specifik Karakteristik fra et kvalitativt og kvantitativt synspunkt af de interactome proteiner domæner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Folde reportere er proteiner med let identificerbare fænotyper, såsom antibiotikaresistens, hvis folde og funktion er kompromitteret når smeltet til dårligt folde proteiner eller tilfældige åbne læserammer. Vi har udviklet en strategi hvor, ved hjælp af TEM-1 β-lactamase (det enzym der giver ampicillin-resistensen) på en genomisk skala, kan vi vælge samlinger af korrekt foldet protein domæner fra den kodende del af DNA af enhver intronless genom. Protein fragmenter opnået ved denne tilgang, den såkaldte "domainome", vil være udtrykt og opløselig, hvilket gør dem egnet til strukturelle/funktionelle studier.
Ved kloning og viser "domainome" direkte i en phage displaysystem, har vi viste, at det er muligt at vælge bestemte protein domæner med de ønskede bindende egenskaber (f.eks., at andre proteiner eller antistoffer), hvilket giver væsentlig eksperimentelle information til gen annotation eller antigen identifikation.
Identifikation af de mest beriget kloner i valgte polyklonale indbyggere kan opnås ved hjælp af nye næste generation sequencing teknologier (NGS). Af disse grunde har indføre vi dyb sekventering analyse af selve biblioteket og udvalg udgange til at give komplette oplysninger om mangfoldighed, tæthed og præcis kortlægning af hver af de valgte fragment. Protokollerne præsenteres her viser de vigtigste skridt for bibliotek opbygning, karakterisering og validering.

Den filtrering tilgang er skematiserede i figur 1. Hver art af intronless DNA kan bruges. I figur 1A den første del af metoden filtrering er repræsenteret: efter indlæsning på en agarosegel eller en bioanalyzer, en god fragmentering af DNA af interesse vises som et udstrygningspræparat af fragmenter med en længde fordeling i den ønskede størrelse af 150-750 bp. En repræsentativ virtuelle gel billede af fragmenterede DNA ...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokol til Domainome bibliotek konstruktion, validering og udvælgelse af Phage Display og næste Generation Sequencing

De protokoller er beskrevet tillader opbygning, karakterisering og udvælgelse (mod mål på valg) af en "domainome" bibliotek fra DNA-kilder. Dette opnås ved en forskning rørledning, der kombinerer forskellige teknologier: phage display, en falsning reporter og næste generation sequencing med en web-værktøj til dataanalyse.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i proteinbaseret forskning såsom anmærkning af nye proteiner eller proteindomæner, karakterisering af kendte proteiners strukturelle og funktionelle egenskaber, definition af proteininteraktionsnetværk eller antigenantistofsignaturer under forskellige forhold. Den største fordel ved denne teknik er, at det er helt upartisk, høj gennemløb og modulære for enhver form for undersøgelse lige fra et enkelt gen op til et helt genom. Opførelsen af et domainone bibliotek er meget nyttigt for funktionelle undersøgelser.Det kan overføres til en display sammenhæng og anvendes til udvælgelse mod forskellige mål såsom bindende proteiner eller rensede antistoffer. Koblingen med NGS muliggør en ekstremt følsom og kraftfuld analyse. Samtidig giver de webværktøjer, der er specielt udviklet, en præcis karakterisering af hele domainome og interactome.At konstruere ORF biblioteket først, sonikere DNA med 30 sekunderimpulser på 100% output. Efter sonikering, indlæse stigen og sonikeret DNA på en 1,5% agarose gel. Start derefter elektroforeseenheden med fem volt pr. centimeter i 15 minutter.Den agarose gel elektroforese viser tilstedeværelsen af DNA smøre bekræfter sonikering. Dette er i forhold til det faste bånd, der er fremstillet af et DNA, der ikke udsættes for sonikering. Skær derefter geldelen med den fragmenterede DNA-udtværing og rengør ved hjælp af kolonnebaseret geludsugningssæt.Mål koncentrationen af det rensede DNA i UV-spektrofotometeret. Følg derefter producentens anvisninger og behandle fem mikrogram af indsatsen med en mikroliter af hurtig afstumpede enzymblanding. Derefter inaktiveres enzymblandingen ved 70 grader Celsius i 10 minutter.For at forberede filtreringsvektoren skal du først fordøje fem mikrogram af den rensede kloningsvektor med EcoRV-begrænsningsenzymet. Derefter indlæses de fordøjede og ufordøjede vektorer og den molekylære markør på en 1% agarosegel. Derefter opvarmes restriktionsenzymet ved 80 grader Celsius i 20 minutter.Dernæst fosforlat den fordøjede vektor med fem enheder af fosfataseenzym og 1/10 volumen af 10X fosfatase buffer. Derefter inkubere blandingen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Derefter inaktiveres fosfataseenzymet ved 65 grader Celsius i fem minutter.Dernæst udtrække plasmid fra gelen og rense DNA. Derefter måle koncentrationen af DNA i UV spektrofotometer. For at udføre ligationsreaktionen tilsættes 400 nanogram af fosforylerede skær til et mikrogram fordøjet vektor, 10X T4 DNA ligase buffer og T4 DNA ligase til et endeligt volumen på 100 mikroliter.Derefter inkubere ligation reaktion ved 16 grader Celsius for natten. Den næste dag, varme inaktivere ligase ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Dernæst tilsættes 1/10 volumen af tre molar natriumacetat ved pH 5.2 og 2.5 volumener af 100% ethanol til at udfælde ligationsproduktet.For at udfælde DNA blandes reagenserne og fryses ved minus 80 grader Celsius i 20 minutter. Efter 20 minutter, centrifuge ved højeste hastighed i 20 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering, udvise supernatant.Til pellet, tilsæt 500 mikroliter af kold 70% ethanol og igen centrifuge. Supernatanten kasseres ved centrifugeringsens afslutning. Når pellet er lufttørret, opløses det udfældede DNA i 10 mikroliter vand.Før elektroporationen udføres, skal der sørges for et passende antal mikrocentrifugerør og 0,1 centimeter elektroporation cuvetter på is. Derefter tilsættes en mikroliter af det rensede ligationsprodukt til 25 mikroliter af cellerne. Derefter pipette DNA, celle blanding til den kolde elektroporation cuvette og svirp røret.Tør derefter vandet fra cuvette'ens ydre og placer det i elektroporationsenheden, og tryk pulsen. Efter elektroporationen er overstået, hurtigt tilføje en milliliter flydende 2X YT medium uden antibiotika til cellerne i cuvette. Overfør derefter den cellulære blanding til et 10 milliliterrør.Efterlad røret på en shaker ved 220 omdrejninger i minuttet ved 37 grader Celsius i en time. Plade fortyndingerne af biblioteket på 10 centimeter 2X YT agar plader suppleret med chloramphenicol, ampicillin og kun chloramphenicol. Dette er for at opnå enkelte kolonier, der skal testes af PCR og til at udføre titrering.Dernæst plade de transformerede kompetente celler på 15 centimeter 2X YT agar plader suppleret med chloramphenicol og ampicillin. Derefter inkubere pladerne ved 30 grader Celsius for natten. Den næste dag, tælle kolonierne vælge fortynding, hvor de er tællelige.Beregn derefter bibliotekets størrelse. Biblioteksstørrelse beregnes som følger, gennemsnitlige koloni antal gange fortynding faktor gange samlede bibliotek volumen. Bibliotek størrelse bør være i den rækkefølge af 10 til magt seks kloner.Hvis ampicillinkoncentrationen er optimal til at udføre mere filtrering, reduceres klonnummeret til en til 20 af det, der opnås uden dette antibiotikum. For at teste for de positive kolonier, bruge et tip til at afhente omkring 15 til 20 enkelte kolonier. Derefter fortyndes kolonierne med 100 mikroliter af 2X YT medium uden antibiotika.Dernæst forstærker PCR 0,5 mikroliter af kulturen som DNA-skabelon med Taq DNA polymerase. Under PCR, køre 25 cyklusser af forstærkninger ved hjælp af glødende temperatur på 55 grader Celsius og en forlængelsestid på 40 sekunder ved 72 grader Celsius. Kontroller, at længden af indsatsen er i det forventede område på 150 til 750 basispar.Og at forskellige kolonier præsentere forskellige skær med forskellig størrelse. Dette indikerer en god bibliotek forberedelse med hensyn til variabilitet. Dernæst tilsættes tre milliliter frisk 2X YT medium til 150 millimeter plader til at indsamle bakterier.Derefter høste bakterierne ved hjælp af en steril skraber. Efter blanding grundigt, tilsæt 20% glycerol og lad i minus 80 grader Celsius i aliquots til fremtidig brug. Til øjeblikkelig brug udføres kolonnebaseret plasmidekstraktionssæt for at rense plasmid-DNA'et fra en af bibliotekets aliquots, før glycerol tilsættes.Strube koncentrationen af DNA'et i UV-spektrofotometeret, og opbevar derefter prøverne på minus 20 grader Celsius, indtil de anvendes. Brug 2,5 mikroliter af biblioteket som DNA-skabelon til PCR-forstærkning. Indstil termocyrforholdene, og start kørslen.Brug derefter et PCR-indekssæt til at udføre indeks-PCR. Dette vil sekvensere de dobbelte indekserede biblioteker inden for multiplexed Illumina kører. Indstil derefter termocyrens betingelser, og start løbet.Efter rensning med AMPure XP perler, for at kontrollere størrelsen, køre en mikroliter af den ene til 10 fortynding af det endelige bibliotek på bioanalyzer. Kvantificer derefter ved at vælge området for den endelige bibliotekssporing. Disse skematiske repræsentationer demonstate, at efter kloning i P filter vektor, kun kolonier svarende til ORFs producere funktionelle beta-lactamase i overværelse af antibiotika.Efter filtrering forventes et fald i klonnummeret på 20 gange. Med god-mappe ORFs vokser ved højere antibiotika koncentrationer. Desuden kan ORF fragmenter let inddrives fra det filtrerede bibliotek.Et phagemid ORF bibliotek er konstrueret til at udføre display udvælgelse mod mål proteiner eller antistoffer. Alle biblioteker og de opnåede udgange analyseres derefter dybt af NGS. NGS giver en fuldstændig information om bibliotekets mangfoldighed, overflod og præcis kortlægning af hver af de udvalgte fragmenter.Endelig interactome søge webtool udviklet genererer rå sekventering læser lige til listen over formodede domæner med genomiske anmærkninger. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man konstruerer og validere et domainome bibliotek fra en ønsket DNA-kilde. Og for at udføre en høj gennemløbsscreening af biblioteket ved næste generations sekvensering.Vi har optimeret rækkefølgen af ORF filtrering biblioteker med Illumina platforme og udviklet en webtool, der gør det muligt at analysere denne form for data uden behov for programmering færdigheder.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Næste generations sekventering af 16S ribosomalt RNA Gene Amplikoner

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA methyleringsanalyse by Next generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' enden sekventering bibliotek forberedelse med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Kryds Microbiome karakterisering af næste generations 16S rRNA-amplikon sekventering

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...