Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem italienischen Ministerium für Bildung und Universität (2010P3S8BR_002, CP).

1. Aufbau der ORF-Bibliothek (Abbildung 1)
<ol><li>Vorbereitung der Einsatz DNA
	<ol>
<li>
Vorbereitung von synthetischen oder genomische DNA-Fragmente
		<ol>
<li>Extrakt/DNA mit Standardmethoden26zu reinigen.</li>
			<li>Fragment-DNA durch Ultraschallbehandlung. Wenn mit einem standard sonikator als allgemeine Anregung Start mit 30 s-Pulse bei 100 % Leistung. Hinweis: Pilot Versuche sollten mit unterschiedlicher Leistung und Bes...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Die Schaffung einer qualitativ hochwertige unterschiedlichsten ORFs gefilterte Bibliothek ist der erste wichtige Schritt in dem gesamten Verfahren, da sie die nachfolgenden Schritte der Pipeline beeinflussen.
Ein wichtiges Merkmal der Vorteil unserer Methode ist, dass jede Quelle (intronless) DNA (cDNA, genomische DNA, PCR abgeleitet oder synthetische DNA) geeignet für Bibliotheksbau. Der erste Parameter, der berücksichtigt werden sollte ist, dass die Länge der DNA-Fragmente in der pFILTER-...

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode für den Bau und die Auswahl der Bibliotheken der gefalteten und lösliches Protein Domänen aus jeder genic/genomische ab Quelle. Der Ansatz kombiniert drei verschiedene Technologien: Phagen-Display, die Verwendung eines klappbaren Reporter und nächsten Generation Sequencing (NGS) mit einer speziellen Web-Tool für die Datenanalyse. Die Methoden können in vielen verschiedenen Zusammenhängen von Protein-basierten Forschung verwendet werden, für Identifikation und Kommentierung der neuen Proteine-Eiweiß-Domains, Charakterisierung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften des bekannten Proteine sowie Definition von Protein-Interaktion Netzwerk.
Viele offene Fragen sind nach wie vor in Protein-basierten Forschung und die Entwicklung von Methoden für optimale Protein-Produktion ist eine wichtige Notwendigkeit für mehrere Felder der Untersuchung. Zum Beispiel fehlt trotz der Verfügbarkeit von Tausenden von prokaryotischen und eukaryotischen Genomen1, eine entsprechende Karte von der relativen Proteome mit eine direkte Anmerkung der kodierten Proteine und Peptide für die große Mehrheit der Organismen. Der Katalog der komplette Proteome taucht als ein anspruchsvolles Ziel, einen riesigen Aufwand an Zeit und Ressourcen erfordern. Der Goldstandard für experimentelle Annotation bleibt das Klonen von alle Open Reading Frames (ORFs) eines Genoms Bau der so genannten "ORFeome". In der Regel Genfunktion Basierend auf Homologie zu verwandten Genen bekannte Tätigkeit zugewiesen, aber dieser Ansatz ist schlecht genau aufgrund der Anwesenheit von vielen falschen Anmerkungen in der Referenz Datenbanken2,3,4, 5. Darüber hinaus auch für Proteine, die identifiziert und kommentiert haben, zusätzliche Studien sind verpflichtet, Charakterisierung in Bezug auf Fülle, Expressionsmuster in unterschiedlichen Kontexten, einschließlich der strukturelle und funktionelle Eigenschaften sowie Interaktion-Netzwerke.
Darüber hinaus da Proteine aus verschiedenen Domänen, jeder von ihnen bestehen zeigt Besonderheiten und anders zu Proteinfunktionen beitragen, die Studie und die genaue Definition dieser Domains können ein noch umfassenderes Bild, sowohl bei den einzelnen gen und auf das vollständige Genom-Ebene. Diese notwendigen Informationen macht Protein-basierten Forschung einem breiten und anspruchsvollen Bereich.
In dieser Perspektive könnte ein wichtiger Beitrag durch unvoreingenommene und Hochdurchsatz-Methoden für die Proteinproduktion gegeben werden. Allerdings beruht der Erfolg solcher Ansätze, neben der erheblichen Investition erforderlich ist, auf der Fähigkeit, lösliche/Stall Protein Konstrukte zu produzieren. Dies ist ein wichtiger Faktor zu begrenzen, da es wurde geschätzt, dass nur etwa 30 % der Proteine können erfolgreich ausgedrückt und produziert in ausreichendem Maße experimentell nützlich6,7,8. Eine Annäherung an diese Beschränkung zu überwinden basiert auf der Verwendung von nach dem Zufallsprinzip fragmentierte DNA herstellen verschiedene Polypeptide, die zusammen überlappende Fragment Darstellung einzelner Gene. Nur ein kleiner Prozentsatz der zufällig generierte DNA-Fragmente sind funktionale ORFs, während die große Mehrheit von ihnen sind nicht-funktionale (wegen des Vorhandenseins des Stop-Codons in ihre Sequenzen) oder codieren für unnatürlich (ORF in einem Frame als das Original) Polypeptide mit keine biologische Bedeutung.
Um diese Probleme zu beheben, hat unsere Fraktion eine Hochdurchsatz-Protein Ausdruck und Interaktion Analyse-Plattform entwickelt, die auf genomischer Ebene9,10,11,12verwendet werden kann. Diese Plattform integriert die folgenden Techniken: 1) eine Methode, um Sammlungen von korrekt gefaltete Protein Domains wählen Sie die Codierung Teil der DNA von jedem Organismus; (2) die Phagen-Display-Technologie für die Auswahl der Partner von Interaktionen; (3) die NGS vollständig charakterisieren die ganze Interaktom untersucht und die Klone von Interesse zu identifizieren; und 4) eine Web-Tool für die Datenanalyse für Anwender ohne Programmierkenntnisse oder Bioinformatik Interaktom-Seq-Analyse in eine einfache und benutzerfreundliche Weise durchführen.
Die Nutzung dieser Plattform bietet wichtige Vorteile gegenüber alternativen Strategien der Untersuchung; die Methode ist vor allem völlig unvoreingenommene, Hochdurchsatz- und modular für Studie, die von einem einzigen Gen bis zu einem ganzen Genom. Der erste Schritt der Pipeline ist die Schaffung einer Bibliothek von nach dem Zufallsprinzip fragmentierte DNA unter Studie, die von NGS dann tief geprägt ist. Diese Bibliothek wird über ein veränderter Vektor wo werden Gene/Fragmente des Interesses geklont, zwischen einer Signalsequenz für Protein Sekretion in den periplasmatischen Raum (d.h. ein Sec-Führer) und das TEM1 β-Lactamase-gen erzeugt. Fusionsproteins wird Ampicillin-Resistenz und die Fähigkeit, unter Druck von Ampicillin nur überleben, wenn geklonten Fragmente im Rahmen sind verleihen diese Elemente und die daraus resultierenden Schmelzverfahren Protein ist korrekt gefaltet10,13 ,14. Alle Klone gerettet, nachdem Antibiotika Auswahl, die so genannte "gefiltert-Klone", sind ORFs und eine große Mehrheit von ihnen (mehr als 80 %), echte Gene9abgeleitet sind. Darüber hinaus liegt die Stärke dieser Strategie in die Ergebnisse, dass alle ORF gefiltert Klone für korrekt gefaltet/lösliche Proteine/Domänen15codieren. Wie viele Klone, vorhanden in der Bibliothek und die Zuordnung in der gleichen Region/Domäne, verschiedene Start- und Endpunkte haben, ermöglicht das unvoreingenommene, einstufigen Identifikation der minimale Fragmente, die lösliche Produkte führen dürften.
Eine weitere Verbesserung in der Technologie ist durch die Verwendung von NGS gegeben, um die Bibliothek zu charakterisieren. Die Kombination dieser Plattform und eine spezielle Web-Tool für die Datenanalyse gibt wichtige objektive Informationen über die genauen Nukleotidsequenzen und über den Standort des ausgewählten ORFs auf dem Referenz-DNA unter Studie ohne weitere umfangreiche Analysen oder experimentellen Aufwand.
Domainome Bibliotheken können in einem Auswahlkontext übertragen und als ein universelles Instrument verwendet, um funktionelle Studien durchführen. Die Hochdurchsatz-Protein Ausdruck und Interaktion Analyseplattform, dass wir integriert und dass wir Interaktom-Seq genannt die Phagen-Display-Technologie nutzt durch Übertragung den gefilterten ORF in einen Phagemid Vektor und die Schaffung von einem Phagen-ORF Bibliothek. Einmal neu geklont in einem Phagen Anzeigekontext Protein Domains auf der Oberfläche der M13 Partikel angezeigt; auf diese Weise können Domainome Bibliotheken für Genfragmente Codierung Domains mit spezifischen enzymatischen Aktivitäten oder bindende Eigenschaften, so dass Interaktom Netzwerke Profilerstellung direkt ausgewählt werden. Dieser Ansatz wurde ursprünglich von Zacchi Et Al. beschrieben. 16 und später in mehreren anderen Kontext13,17,18verwendet.
Im Vergleich zu anderen Technologien zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion (einschließlich Hefe-zwei-Hybrid-System und Massenspektrometrie19,20), ist ein großer Vorteil die Verstärkung der Bindungspartner, die auftritt, während Phagen mehrfache Umläufe der Auswahl angezeigt. Dies erhöht die Auswahl-Empfindlichkeit, so dass die Identifizierung der niedrigen reichlich Bindeproteine Domänen in der Bibliothek vorhanden. Die Effizienz der Auswahl mit ORF-gefilterte Bibliothek durchgeführt wird aufgrund des Fehlens von nicht-funktionalen Klone weiter erhöht. Schließlich ermöglicht die Technologie die Auswahl gegen Eiweiß und nicht-Protein Köder21,22,23,24,25durchgeführt werden.
Phagen-Auswahl mit Hilfe der Domainome-Phagen-Bibliothek können mit Antikörpern im Serum von Patienten mit verschiedenen pathologischen Bedingungen, z.B. Autoimmunerkrankungen13, Krebs oder Infektionen Krankheiten als Köder aus durchgeführt werden. Dieser Ansatz wird verwendet, um zu erhalten die so genannte "Antikörper Signatur" der Krankheit unter Studie damit massiv zu identifizieren und zu charakterisieren die Antigene/Epitope speziell zur gleichen Zeit von der Patienten Antikörper erkannt. Im Vergleich zu anderen Methoden der Verwendung von Phagen-Display ermöglicht die Identifikation von sowohl lineare als auch Konformationsänderungen Antigenen Epitope. Die Identifikation einer bestimmten Signatur könnte einen wichtigen Einfluss für Verständnis Pathogenese, neue Impfstoff-Design, Identifikation von neuen therapeutischen Ziele und Entwicklung von neuen und spezifischen diagnostischen und prognostischen Tools haben. Darüber hinaus Wenn die Studie auf Infektionskrankheiten konzentriert ist, ist ein großer Vorteil, dass die Entdeckung der Immunogenen Proteine unabhängig vom Erreger Anbau.
Unser Ansatz bestätigt, dass die Faltung Reporter auf genomischer Ebene verwendet werden können, um die "Domainome" wählen: eine Sammlung von korrekt gefaltet, gut ausgedrückt, lösliches Protein Domains aus der Codierung Teil der DNA bzw. cDNA von jedem Organismus. Einmal isoliert die PROTEINFRAGMENTE eignen sich für viele Zwecke, mit wesentlichen experimentelle Informationen für gen-Anmerkungen sowie für strukturelle Studien, Antikörper Epitop Mapping, Antigen-Identifikation. Die Vollständigkeit der Hochdurchsatz-Daten zur Verfügung gestellt von NGS ermöglicht die Analyse von hochkomplexen Proben, wie Phagen-Display-Bibliotheken, und hat das Potenzial, das traditionelle mühsam sammeln und Prüfung von einzelnen Phagen gerettet Klone zu umgehen.
Zur gleichen Zeit dank der Funktionen der gefilterten Bibliothek und die extreme Empfindlichkeit und macht die NGS-Analyse ist es möglich, die Protein-Domäne verantwortlich für jede Interaktion direkt in ein Einstiegsbild, ohne die Notwendigkeit der Schaffung zu identifizieren zusätzliche Bibliotheken für jede gebunden Protein. NGS ermöglicht eine umfassende Definition von der ganzen Domainome gen/genomische ab Quelle und das Web-Tool zur Datenanalyse ermöglicht die Erlangung von eine hochspezifische Charakterisierung von qualitativer und quantitativer Sicht von der Interaktom Proteine Domänen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Klappbare Reporter sind Proteine mit leicht erkennbaren Phänotypen, wie z. B. Antibiotika-Resistenz, dessen Falten und Funktion beeinträchtigt wird, wenn schlecht Faltung von Proteinen oder zufällige open Reading Frames verschmolzen. Wir haben eine Strategie entwickelt, kann mithilfe von TEM-1 β-Lactamase (das Enzym überträgt die Ampicillin-Resistenz) auf genomischer Ebene, Sammlungen von korrekt gefaltete Protein Domains wählen wir aus der Codierung Teil der DNA von jedem intronless Genom. Die PROTEINFRAGMENTE erhalten durch diesen Ansatz, der so genannte "Domainome", werden gut ausgedrückt und löslich, so dass sie für strukturelle und funktionelle Studien sein.
Von Klonen und die Anzeige "Domainome" direkt in einem Phagen-Display-System, haben wir zeigten, dass spezifisches Protein Domains mit der gewünschten Bindeeigenschaften (z. B. an andere Proteine oder Antikörper), wählen dadurch wesentlich kann experimentellen Daten für gen-Annotation oder Antigen-Identifikation.
Die Identifikation der meisten angereicherten Klone in einer ausgewählten polyklonale Population kann mithilfe von Technologien neuartige Next Generation Sequencing (NGS) erreicht werden. Aus diesen Gründen stellen wir Tiefe Sequenzierung Analyse der Bibliothek selbst und die Auswahl-Ausgänge, komplette Informationen über Vielfalt, Fülle und genaue Kartierung aller ausgewählten Fragment. Die hier vorgestellten Protokolle zeigen die wichtigsten Schritte für Bibliotheksbau, Charakterisierung und Validierung.

Die Filterung Ansatz ist in Abbildung 1schematisiert. Jede Art von intronless DNA kann verwendet werden. In Figur 1A ist der erste Teil der Filterung Ansatz vertreten: nach dem Laden auf einem Agarosegel oder einem Bioanalyzer eine gute Fragmentierung der DNA von Interesse erscheint als ein Abstrich der Fragmente mit einer Länge in der gewünschten Größe 150-750 bp. Eine repräsentative virtuelle Gelbild der fragmentierten DNA...

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Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in der proteinbasierten Forschung zu beantworten, wie die Annotation neuer Proteine oder Proteindomänen, die Charakterisierung struktureller und funktioneller Eigenschaften bekannter Proteine, die Definition von Protein-Interaktionsnetzwerken oder Antigen-Antikörpersignaturen unter verschiedenen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie völlig unvoreingenommen, hoher Durchsatz und modular für jede Art von Studie ist, die von einem einzelnen Gen bis zu einem ganzen Genom reicht. Der Aufbau einer Domainone-Bibliothek ist sehr nützlich für Funktionsstudien.Es kann in einen Phagenanzeigekontext übertragen und für die Auswahl gegen verschiedene Targets wie Bindungsproteine oder gereinigte Antikörper verwendet werden. Die Kopplung mit NGS ermöglicht eine äußerst sensible und leistungsstarke Analyse. Gleichzeitig geben die speziell entwickelten Web-Tools eine präzise Charakterisierung der gesamten Domainome und Interactome.Um die ORF-Bibliothek zuerst zu konstruieren, beschallen Sie die DNA mit 30 Sekunden Impulsen bei 100%Output. Laden Sie nach der Beschallung die Leiter und die beschallte DNA auf ein 1,5%agarose Gel. Dann starten Sie die Elektrophoreseeinheit bei fünf Volt pro Zentimeter für 15 Minuten.Die Agarose-Gel-Elektrophorese zeigt das Vorhandensein von DNA-Abstrichen, die die Beschallung bestätigen. Dies ist im Vergleich zu dem festen Band, das aus einer DNA gewonnen wird, die keiner Beschallung unterzogen wird. Schneiden Sie dann den Gelanteil mit dem fragmentierten DNA-Abstrich und reinigen Sie ihn mit dem säulenbasierten Gelextraktionskit.Messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA im UV-Spektralphotometer. Dann folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und behandeln Sie fünf Mikrogramm des Einsatzes mit einem Mikroliter schnell stumpfen Enzymmischung. Dann inaktivieren Sie die Enzymmischung bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten.Um den Filtervektor vorzubereiten, verdauen Sie zunächst fünf Mikrogramm des gereinigten Klonvektors mit dem EcoRV-Restriktionsenzym. Dann laden Sie die verdauten und unverdaute Vektoren und den molekularen Marker auf ein 1%Agarose-Gel. Dann inaktivieren Sie das Restriktionsenzym bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten.Als nächstes phosphoryliert der verdaute Vektor mit fünf Einheiten Phosphatase-Enzym und einem Volumen von 1/10 des 10-fachen Phosphatase-Puffers. Dann inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Dann inaktivieren Sie das Phosphatase-Enzym bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.Als nächstes extrahieren Sie das Plasmid aus dem Gel und reinigen Sie die DNA. Messen Sie dann die Konzentration der DNA im UV-Spektralphotometer. Um die Ligationsreaktion durchzuführen, fügen Sie 400 Nanogramm der phosphorylierten Inserts zu einem Mikrogramm verdauten Vektors, 10X T4 DNA-Ligasepuffer und T4-DNA-Ligase zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu.Dann inkubieren Sie die Ligationsreaktion bei 16 Grad Celsius für die Nacht. Am nächsten Tag, Hitze inaktivieren die Ligase bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes fügen Sie 1/10 Volumen von drei Mol-Natriumacetat bei pH 5.2 und 2,5 Volumen von 100%Ethanol, um das Ligationsprodukt zu fällen.Um die DNA zu fällen, mischen Sie die Reagenzien und frieren sie bei minus 80 Grad Celsius für 20 Minuten ein. Nach 20 Minuten Zentrifuge bei höchster Geschwindigkeit für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vertreiben.Zum Pellet 500 Mikroliter kaltes 70%Ethanol und wieder Zentrifuge hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand am Ende der Zentrifugation. Sobald das Pellet luftgetrocknet ist, lösen Sie die gefällte DNA in 10 Mikroliter Wasser auf.Vor der Durchführung der Elektroporation die entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhren und 0,1 Zentimeter Elektroporationsküvetten auf Eis anordnen. Dann einen Mikroliter des gereinigten Ligationsprodukts zu 25 Mikrolitern der Zellen hinzufügen. Dann Pipette die DNA, Zellmischung auf die kalte Elektroporation Küvette und flickt die Röhre.Wischen Sie dann das Wasser von der Außenseite der Küvette ab und legen Sie es in die Elektroporationseinheit und treffen Sie den Puls. Nachdem die Elektroporation vorbei ist, fügen Sie schnell einen Milliliter flüssiges 2X YT Medium ohne Antibiotikum in die Zellen in der Küvette. Dann übertragen Sie die Zellmischung in eine 10 Milliliter Tube.Lassen Sie die Röhre auf einem Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Die Verdünnungen der Bibliothek auf 10 Zentimeter n2X YT Agarplatten mit Chloramphenicol, Ampicillin und nur Chloramphenicol ergänzt. Dies ist, um einzelne Kolonien zu erhalten, die durch PCR getestet werden und Titration durchführen.Als nächstes die transformierten kompetenten Zellen auf 15 Zentimeter 2X YT Agarplatten mit Chloramphenicol und Ampicillin ergänzt. Dann die Platten bei 30 Grad Celsius für die Nacht inkubieren. Am nächsten Tag zählen die Kolonien, die die Verdünnung wählen, wo sie zählbar sind.Berechnen Sie dann die Bibliotheksgröße. Die Bibliotheksgröße wird wie folgt berechnet, die mittlere Koloniezahl mal Verdünnungsfaktor mal das gesamte Bibliotheksvolumen. Die Bibliotheksgröße sollte in der Größenordnung von 10 bis zur Leistung von sechs Klonen sein.Wenn die Ampicillinkonzentration optimal ist, um mehr Filterung durchzuführen, verringert sich die Klonzahl auf ein bis 20 der, die ohne dieses Antibiotikum erhalten wird. Um die positiven Kolonien zu testen, verwenden Sie einen Tipp, um etwa 15 bis 20 einzelne Kolonien aufzunehmen. Dann verdünnen Sie die Kolonien mit 100 Mikroliter 2X YT Medium ohne Antibiotika.Als nächstes verstärkt PCR 0,5 Mikroliter der Kultur als DNA-Vorlage mit Taq-DNA-Polymerase. Während der PCR laufen 25 Zyklen von Verstärkungen mit Glühtemperatur von 55 Grad Celsius und einer Verlängerungszeit von 40 Sekunden bei 72 Grad Celsius. Stellen Sie fest, dass die Länge des Einsatzes im erwarteten Bereich von 150 bis 750 Basispaar liegt.Und dass verschiedene Kolonien verschiedene Einsätze mit unterschiedlicher Größe präsentieren. Dies deutet auf eine gute Bibliotheksvorbereitung in Bezug auf die Variabilität hin. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter frisches 2X YT Medium auf die 150-Millimeter-Platten, um die Bakterien zu sammeln.Dann ernten Sie die Bakterien mit einem sterilen Schaber. Nach dem Mischen gründlich, fügen Sie 20% Glycerin und lassen Sie in minus 80 Grad Celsius in Aliquots für die zukünftige Verwendung. Für die sofortige Anwendung, führen Sie spaltenbasierte Plasmid Extraktion Kit, um die Plasmid-DNA aus einem der Aliquots der Bibliothek zu reinigen, bevor Sie Glycerin hinzufügen.Messen Sie die Konzentration der DNA im UV-Spektralphotometer und speichern Sie die Proben dann bei minus 20 Grad Celsius bis zur Verwendung. Verwenden Sie 2,5 Mikroliter der Bibliothek als DNA-Vorlage für die PCR-Verstärkung. Stellen Sie die Thermocycler-Bedingungen ein und starten Sie den Lauf.Verwenden Sie als Nächstes ein Index-PCR-Kit, um Index-PCR auszuführen. Dadurch werden die doppelten indizierten Bibliotheken innerhalb multiplexierter Illumina-Läufe sequenziert. Stellen Sie dann die Thermocycler-Bedingungen ein und starten Sie den Lauf.Nach der Reinigung mit AMPure XP Perlen, um die Größe zu überprüfen, führen Sie einen Mikroliter der ein bis 10 Verdünnung der endgültigen Bibliothek auf dem Bioanalyzer. Anschließend quantifizieren Sie, indem Sie den Bereich der endgültigen Bibliotheksablaufverfolgung auswählen. Diese schematischen Darstellungen zeigen, dass nach dem Klonen in P-Filtervektor nur Kolonien, die ORFs entsprechen, funktionelle Beta-Lactamase in Gegenwart von Antibiotika produzieren.Nach dem Filtern wird eine Abnahme der Klonzahl um das 20-fache erwartet. Mit Good-Folder-ORFs, die in höheren Antibiotikakonzentrationen wachsen. Darüber hinaus können die ORF-Fragmente einfach aus der gefilterten Bibliothek wiederhergestellt werden.Eine Phagenmid-ORF-Bibliothek ist so konstruiert, dass eine Phagenanzeige-Auswahl gegen Zielproteine oder Antikörper durchgeführt wird. Alle Bibliotheken und die erhaltenen Ergebnisse werden dann vom NGS eingehend analysiert. Das NGS bietet eine vollständige Information über Bibliotheksvielfalt, Fülle und präzise Kartierung jedes der ausgewählten Fragmente.Schließlich erzeugt das interactome seek webtool developed rohe Sequenzierungslesevorgänge, die bis zur Liste der vermeintlichen Domänen mit genomischen Anmerkungen reichen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Domainome-Bibliothek aus einer gewünschten DNA-Quelle erstellen und validieren. Und um eine Überprüfung der Bibliothek mit hohem Durchsatz durch Sequenzierung der nächsten Generation durchzuführen.Wir haben die Sequenzierung der ORF-Filterbibliotheken mit den Illumina-Plattformen optimiert und ein Webtool entwickelt, das die Analyse dieser Art von Daten ohne Programmierkenntnisse ermöglicht.

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