Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק האיטלקי משרד החינוך ואוניברסיטת (2010P3S8BR_002 כדי CP).

1. בניית הספרייה ORF (איור 1)
<ol><li>הכנת הכנס ה-DNA
	<ol>
<li>
הכנה קטעים מ- DNA סינטטיים או גנומית
		<ol>
<li>תמצית/DNA תוך שימוש בשיטות הרגילות26לטהר.</li>
			<li>קטע דנ א על ידי sonication. אם משתמש של sonicator סטנדרטי, בתור התחלה הצעה כללית עם פולסים s 30 ב- 100% כוח פלט. הערה: ט...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

הקמת ספרייה באיכות גבוהה המסוננות ORFs מגוונת מאוד הוא השלב הקריטי הראשון כל התהליך מאז זה ישפיע על כל השלבים הבאים של הצינור.
יתרון תכונה חשובה של השיטה שלנו היא כי כל מקור ה-DNA (intronless) (cDNA, הדנ א, ה-PCR נגזר או דנ א סינתטי) מתאים ספריית הבנייה. הפרמטר הראשון שצריך לקחת בחשבון הוא כ?...

כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה הבנייה ואת הבחירה של ספריות של חלבון מקופל ולא מסיסים תחומים מכל מקור ההתחלה genic/גנומית. הגישה משלבת בשלוש טכנולוגיות שונות: phage לתצוגה, השימוש של כתב מתקפלים, רצף הדור הבא (הגדרות) עם כלי אינטרנט מסוימים עבור ניתוח נתונים. השיטות ניתן להשתמש בהקשרים שונים רבים של חלבון מבוססת מחקר, זיהוי, ביאור של דומיינים חלבונים/חלבונים חדשים, אפיון של מאפיינים מבניים ופונקציונליים של חלבונים הידועים, כמו גם ההגדרה של רשת אינטרקציה בין חלבונים.
שאלות פתוחות רבות עדיין קיימות במחקר המבוסס על חלבון ונמצא בפיתוח שיטות לייצור חלבון אופטימלי של צורך חשוב מספר שדות של החקירה. לדוגמה, למרות זמינותו של אלפי הגנום prokaryotic, האיקריוטים1, מפת המתאימה proteomes יחסית לביאור ישירה של מקודדת חלבונים ופפטידים חסר עדיין עבור הרוב הגדול של אורגניזמים. הקטלוג של proteomes מוחלט מתגלה כמטרה מאתגר הדורש מאמץ עצום במונחים של זמן ומשאבים. תקן זהב עבור ביאור ניסיוני נשאר השיבוט כל המסגרות פתח קריאה (ORFs) של הגנום, בבניין שנקרא "ORFeome". בדרך כלל פונקציה ג'ין מוקצה על סמך הומולוגיה ל גנים הקשורים בפעילות ידוע אבל גישה זו היא מדויקת לקוי בשל נוכחותם של רבים ביאורים שגוי הפניה מסדי נתונים2,3,4, 5. יתר על כן, אפילו עבור חלבונים מזוהה, מבואר, מחקרים נוספים נדרשים להשיג אפיון מבחינת שפע, דפוסי ביטוי בהקשרים שונים, כולל מאפיינים מבניים ופונקציונליים כמו גם אינטראקציה עם רשתות.
יתר על כן, מאז חלבונים מורכבים של תחומים שונים, כל אחד מהם מציג תכונות ספציפיות, ותרומה שונה פונקציות חלבון, המחקר ואת ההגדרה המדויקת של תחומים אלה יכול לאפשר תמונה מקיפה יותר, הן ברמה הסינגל ג'ין, ברמת הגנום המלא. כל המידע הנחוץ הזה הופך את חלבון מבוססת מחקר שדה רחב ומאתגר.
בפרספקטיבה הזו, יכול לקבל תרומה חשובה על ידי שיטות לא משוחד ואשר תפוקה גבוהה לייצור חלבונים. עם זאת, ההצלחה של גישות כאלה, לצד ההשקעה ניכרת נדרש, מסתמך על היכולת לייצר חלבון מסיס/יציבה בונה. . זה רב סרן הגבלת גורם שכן ההערכה היא כי רק כ- 30% של חלבונים יכולים להיות בהצלחה הביע והפיק ברמות מספיקות כדי להיות שימושי השפעול6,7,8. גישה זו על מנת להתגבר על מגבלה זו מבוססת על השימוש של DNA מפוצלים באופן אקראי כדי לייצר polypeptides שונים, אשר יחד מספקים קטעים חופפים, ייצוג גנים יחידניים. רק אחוז קטן של שברי DNA שנוצר באופן אקראי הינם פונקציונליים ORFs בעוד הרוב הגדול של אותם שאינם פונקציונליים (בשל נוכחותם של עצירה codons בתוך והרצפים שלהם) או קידוד עבור האו ם טבעי (ORF בתוך מסגרת שונה מהמקור) polypeptides ללא משמעות ביולוגית.
כדי לטפל בכל הנושאים האלה, הקבוצה שלנו פיתחה תפוקה גבוהה חלבון ביטוי ואינטראקציה ניתוח פלטפורמה שניתן להשתמש בהם על11,1210,9,מידה גנומית. פלטפורמה זו משלבת הטכניקות הבאות: 1) שיטה לבחירת אוספים של חלבון מקופל כראוי תחומים מתוך החלק קידוד של ה-DNA מכל יצור; 2 טכנולוגית תצוגה phage) בחירת שותפים של אינטראקציות; 3) המיתרים לחלוטין לאפיין את interactome כל שנבחנה ולזהות השיבוטים של עניין; . ו-4) כלי אינטרנט עבור ניתוח נתונים עבור משתמשים ללא ביואינפורמטיקה או בתכנות לבצע ניתוח Interactome-Seq בצורה קלה וידידותית.
השימוש של פלטפורמה זו מציע יתרונות חשובים על אסטרטגיות אלטרנטיביות של החקירה; מעל כל השיטה זו לחלוטין לא משוחד תפוקה גבוהה, מודולרי למחקר החל גן יחיד עד הגנום כולו. השלב הראשון של הצינור הוא היצירה של ספריה מ- DNA באופן אקראי מפוצלים שנבחנה, המתאפיינת ואז עמוקות המיתרים. ספריה זו נוצרת באמצעות וקטור הנדסה שבו גנים/קטעים מעניינים הם משובטים בין רצף אות על הפרשת חלבון לחלל periplasmic (כלומר, מנהיג שניה) הגן β לקטמאז TEM1. החלבון היתוך להתייעץ אמפיצילין ההתנגדות ואת היכולת לשרוד תחת לחץ אמפיצילין רק אם קטעים משוכפל במסגרת עם רכיבים אלה והן את חלבון כימרי וכתוצאה מכך הוא מקופל כראוי10,13 ,14. שיבוטים כל חולצה אחרי הבחירה אנטיביוטי, שנקרא מסוננים המשובטים", הינם ORFs, רוב גדול של אותם (יותר מ 80 אחוז), נגזרות אמיתי גנים9. יתר על כן, הכוח של אסטרטגיה זו טמון הממצאים כי כל השיבוטים ORF מסונן קידוד חלבונים כראוי מקופל/מסיסים/תחומים15. כמו שיבוטים רבים, נוכח הספריה ואת מיפוי האזור באותו/תחום, יש שונות להתחלה וסיום נקודות, זה מאפשר זיהוי לא משוחדת, צעד אחר צעד של השברים מינימלית כי צפויים להניב מוצרים מסיסים.
הטבה נוספת בטכנולוגיה ניתנת על ידי שימוש המיתרים לאפיין את הספרייה. השילוב של הפלטפורמה ושל כלי אינטרנט מסוימים עבור ניתוח נתונים נותן מידע לא משוחד חשוב על הרצפים נוקלאוטיד המדויק, על מיקומו של ORFs שנבחרו על ההפניה DNA שנבחנה ללא צורך עוד ניתוחים נרחב או מאמץ ניסיוני.
Domainome ספריות ניתן להעביר לתוך הקשר הנבחר, המשמש כמכשיר האוניברסלי לביצוע מחקרים פונקציונלי. תפוקה גבוהה חלבון ביטוי ואינטראקציה ניתוח הפלטפורמה כי אנו משולב, כי קראנו Interactome-Seq מנצל הטכנולוגיה התצוגה phage על-ידי העברת את ORF מסוננים לתוך וקטור phagemid ויצירת phage-ORF ספריה. פעם מחדש משובטים לתוך הקשר התצוגה phage חלבון תחומים מוצגים על-פני M13 חלקיקים; בדרך זו domainome ספריות ניתן לבחור ישירות עבור ג'ין שברי קידוד תחומים עם פעילויות אנזימטיות ספציפיות או מחייב מאפיינים, ומאפשר רשתות interactome פרופיל. גישה זו תוארה לראשונה על ידי. Zacchi et al. 16 ומאוחר יותר השתמש בכמה אחרים בהקשר13,17,18.
לעומת טכנולוגיות אחרות המשמשות ללימוד אינטראקציית חלבון-חלבון (כולל מערכת היברידית שני שמרים ספקטרומטר מסה19,20), אחד היתרונות העיקריים היא ההגברה של הזוג איגוד המתרחשת במהלך phage הצגת מספר סיבובים של בחירה. זה מגביר את הרגישות הבחירה ובכך מאפשר הזיהוי תחומים של איגוד בשפע נמוך חלבונים קיים בספריה. היעילות של הבחירה ביצע עם ספריה ORF-מסוננים הוא גדל עוד יותר בשל היעדר שיבוטים פונקציונלי. בסופו של דבר, הטכנולוגיה מאפשרת את הבחירה לבצע נגד חלבון והן הלא-חלבון פיתיונות21,22,23,24,25.
בחירות phage בעזרת הספריה domainome-phage יכול להתבצע באמצעות נוגדנים מגיע סרה של חולים עם מצבים פתולוגיים שונים, למשל מחלות אוטואימוניות13, סרטן או זיהום מחלות כפיתיון. גישה זו משמשת כדי להשיג שנקרא "נוגדנים החתימה" של המחלה שנבחנה המאפשר לזהות ולאפיין את אנטיגנים/epitopes במיוחד המוכרות נוגדנים של החולים במקביל בנפט. לעומת שיטות אחרות השימוש של phage התצוגה מאפשר זיהוי epitopes antigenic ליניאריות ולא הסתגלותי. הזיהוי של חתימה ספציפי יכול להיות פוטנציאל השפעה חשובה ההבנה פתוגנזה, עיצוב חיסון חדש, זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ופיתוח של כלי האבחון, prognostic חדשה וספציפי. יתר על כן, כאשר המחקר מתמקדת מחלות זיהומיות, היתרון העיקרי הוא הגילוי של חלבונים immunogenic הוא עצמאי מטיפוח הפתוגן.
הגישה שלנו מאשרת כי הכתבים מתקפלים יכולים לשמש בקנה מידה גנומית כדי לבחור את "domainome": אוסף של חלבון מקופל בצורה נכונה, ביטוי טוב, מסיסים תחומים מחלק קידוד ה-DNA ו/או cDNA מכל יצור. פעם מבודד שברי חלבון שימושיים למטרות רבות, מתן מידע נסיוני חיוני עבור ג'ין ביאור גם לגבי לימודי המבנית, נוגדן epitope מיפוי, זיהוי אנטיגן, וכו '. שלמות התרגום של תפוקה גבוהה נתונים שסופקו על-ידי הגדרות המאפשרת הניתוח של דגימות מאוד מורכבים, כגון ספריות התצוגה phage, ומחזיק את היכולת לעקוף האיסוף מפרך מסורתי ובדיקות של שיבוטים phage בודדים שניצלו.
באותו הזמן בזכות התכונות של הספריה מסוננים וכדי את רגישות קיצונית והכוח של ניתוח המיתרים, זה ניתן לזהות את התחום חלבון אחראי ישירות על המסך הראשוני, ללא צורך ליצור אינטראקציה ספריות נוספות עבור כל אחד מחויב חלבון. הגדרות מאפשר להשיג הגדרה מקיפה כל domainome של כל מקור התחלתי genic/גנומית ומאפשרת בכלי האינטרנט של ניתוח נתונים של הקניית ספציפי מאוד אפיון בשני כמותיים נקודת מבט של התחומים של interactome חלבונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

כתבים מתקפלים הם חלבונים עם פנוטיפים קלות לזיהוי, כגון עמידות לאנטיביוטיקה, אשר מתקפל ותפקוד נפגעת כאשר דבוקה לקוי קיפול חלבונים או מסגרות קריאה פתוחה אקראי. פיתחנו אסטרטגיה שבו, על-ידי שימוש TEM-1 β לקטמאז (האנזים היוועצות ההתנגדות אמפיצילין) בסולם גנומית, אנחנו יכולים לבחור אוספים של תחומים חלבון מקופל כראוי מן החלק קידוד של ה-DNA של כל הגנום intronless. שברי חלבון מתקבל על ידי גישה זו, שנקרא "domainome", תהיה ביטוי היטב מסיסים, שהופך אותם למתאימים ללימודי מבני/תפקודית.
שיבוט ומציג את "domainome" ישירות במערכת התצוגה phage, אנחנו הראו שזה אפשרי לבחור תחומים חלבון ספציפי עם מאפייני האיגוד הרצוי (למשל, לחלבונים אחרים או נוגדנים), ובכך לספק חיוני ניסיוני מידע לזיהוי גנים ביאור או אנטיגן.
הזיהוי של שיבוטים מועשר ביותר בקרב אוכלוסיה polyclonal שנבחר יכולה להיות מושגת באמצעות טכנולוגיות הדור הבא רצפי הרומן (הגדרות). מסיבות אלו, אנו מציגים את רצף עמוק ניתוח של הספריה עצמה והתפוקות הבחירה כדי לספק מידע מלא על גיוון, שפע של מיפוי מדויק של כל אחד המקטע שנבחר. הפרוטוקולים המובאת כאן הצגת השלבים המפתח בניית ספרייה, אפיון של אימות.

גישת הסינון הוא schematized באיור1. ניתן להשתמש בכל סוג של דנ א intronless. איור 1A החלק הראשון של הגישה סינון מיוצג: לאחר טעינה של ג'ל agarose או bioanalyzer, פיצול טוב של ה-DNA של הריבית מופיע כתם של קטעים עם התפלגות האורך בגודל הרצוי של לחץ דם 150-750. תמונת הנציגה ג'...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

הפרוטוקולים תיאר מאפשרים אפיון ובניה, מבחר (נגד המטרה של הבחירה) ספרייה "domainome" גרם מכל מקור ה-DNA. זו מושגת על ידי צינור מחקר המשלב טכנולוגיות שונות: phage התצוגה, כתב מתקפלים, רצף הדור הבא עם כלי אינטרנט לניתוח נתונים.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר מבוסס חלבון כגון ביאור של חלבונים חדשים או תחומי חלבון, אפיון תכונות מבניות ותפקודיות של חלבונים ידועים, הגדרת רשתות אינטראקציה עם חלבונים או חתימות נוגדנים אנטיגן בתנאים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בלתי משוחדת לחלוטין, תפוקה גבוהה ומודולרית לכל סוג של מחקר החל וגן יחיד ועד גנום שלם. בניית ספריית דומיין שימושית מאוד למחקרים פונקציונליים.ניתן להעביר אותו להקשר תצוגת פאג' ו לשמש לבחירה נגד מטרות שונות כגון חלבונים מחייבים או נוגדנים מטוהרים. הצימוד עם NGS מאפשר ניתוח רגיש ורב עוצמה ביותר. יחד עם זאת, כלי האינטרנט שפותחו במיוחד מעניקים אפיון מדויק של כל הדומיין והאינטראקציה.כדי לבנות תחילה את ספריית ORF, יש להפוך את הדנ"א לפולסים של 30 שניות בתפוקה של 100%. לאחר sonication, לטעון את הסולם ואת ה-DNA sonicated על 1.5% ג'ל אגרוז. ואז להתחיל את יחידת אלקטרופורזה בחמישה וולט לסנטימטר במשך 15 דקות.אלקטרופורזה ג'ל agarose מראה את הנוכחות של מריחת DNA המאשר sonication. זאת בהשוואה ללהקה המוצקה המתקבלת מדנ"א שלא היה נתון לניקציה. לאחר מכן חותכים את חלק הג'ל עם מריחת ה- DNA המפוצלת ומטהרים באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מבוססת עמודה.למדוד את הריכוז של ה-DNA מטוהרים בספקטרופוטומטר UV. לאחר מכן בצע את הוראות היצרן ולטפל חמישה מיקרוגרם של הכנס עם microliter אחד של תערובת אנזים קהה מהיר. ואז להשבית את תערובת האנזים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.כדי להכין את וקטור הסינון, לעכל תחילה חמישה מיקרוגרם של וקטור שיבוט מטוהר עם אנזים הגבלת EcoRV. לאחר מכן לטעון את הווקטורים מתעכלים ולא מעוכלים ואת הסמן המולקולרי על 1% ג'ל אגרוז. לאחר מכן מחממים את האנזים המגבלה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.לאחר מכן, זרחן לווקטור מתעכל עם חמש יחידות של אנזים פוספטאז ונפח 1/10 של מאגר פוספטאז 10X. ואז להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ואז להשבית את האנזים פוספטאז ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר מכן, לחלץ את הפלסמיד מן הג'ל לטהר את ה-DNA. ואז למדוד את הריכוז של ה-DNA בספקטרופוטומטר UV. כדי לבצע את תגובת הרצועה, להוסיף 400 ננוגרם של זרחן מוסיף מיקרוגרם אחד של וקטור מתעכל, 10X T4 מאגר רצועות DNA ו T4 DNA ligase לנפח הסופי של 100 microliters.ואז לה הדגירה את תגובת הקשירה ב 16 מעלות צלזיוס ללילה. למחרת, חום להשבית את הליגה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1/10 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ב pH 5.2 ו 2.5 כרכים של 100%אתנול כדי לזרז את המוצר קשירה.כדי לזרז את הדנ"א, מערבבים את הריג'ים ומקפיאים במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, צנטריפוגה במהירות הגבוהה ביותר במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לגרש את העל-טבעי.לכדור, להוסיף 500 microliters של קר 70% אתנול ושוב צנטריפוגה. השלך את העל-טבעי בסוף הצנטריפוגה. ברגע שהכדור מיובש באוויר, ממיסים את הדנ"א המוזרז ב-10 מיקרוליטרים של מים.לפני ביצוע אלקטרופורציה, לארגן את המספר המתאים של צינורות microcentrifuge ו 0.1 ס"מ אלקטרופולציה cuvettes על קרח. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מוצר הקשירה המטוהר ל-25 מיקרוליטרים של התאים. ואז פיפטה ה-DNA, תערובת תאים כדי cuvette אלקטרופורציה קר להעיף את הצינור.ואז לנגב את המים מהחלק החיצוני של cuvette ולמקם ביחידת אלקטרופורציה ופגע הדופק. לאחר אלקטרופורציה נגמר, להוסיף במהירות מיליליטר אחד של נוזל 2X YT בינוני ללא כל אנטיביוטיקה לתאים ב cuvette. ואז להעביר את התערובת התאית לצינור 10 מיליליטר.השאירו את הצינור על שייקר ב 220 מהפכות לדקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה. צלחת את הדילולים של הספרייה על 10 ס"מ 2X YT צלחות אגר בתוספת כלוראמפניקול, אמפיצילין רק כלוראמפניקול. זה כדי להשיג מושבות בודדות להיבדק על ידי PCR ולבצע טיטריות.לאחר מכן, צלחת התאים המוכשרים טרנספורמציה על 15 ס"מ 2X YT צלחות אגר בתוספת כלוראמפניקול ואמפיצילין. ואז לה הדגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס ללילה. למחרת, מחוזות המושבות בוחרים את הדילול שבו הם ניתנים לספירה.לאחר מכן חשב את גודל הספריה. גודל הספריה מחושב באופן הבא, ממוצע מושבה מספר פעמים דילול גורם פעמים נפח הספריה הכולל. גודל הספרייה צריך להיות בסדר של 10 לעוצמה של שישה שיבוטים.אם ריכוז אמפיצילין הוא אופטימלי לבצע סינון יותר, מספר השיבוט מקטין לאחד עד 20 מזה המתקבל בהיעדר אנטיביוטיקה זו. כדי לבדוק את המושבות החיוביות, השתמשו בטיפ כדי לקלוט כ-15 עד 20 מושבות בודדות. לאחר מכן לדלל את המושבות עם 100 microliters של מדיום YT 2X ללא אנטיביוטיקה.לאחר מכן, PCR להגביר 0.5 microliter של התרבות כתבנית DNA עם פולימראז DNA Taq. במהלך PCR, לרוץ 25 מחזורים של הגברה באמצעות טמפרטורת חישול של 55 מעלות צלזיוס ותוספת של 40 שניות ב 72 מעלות צלזיוס. ודא שאורך ההוספה נמצא בטווח הצפוי של 150 עד 750 זוג בסיסים.ומושבות שונות מציגות מוסיף שונה עם גודל שונה. הדבר מצביע על הכנת ספריה טובה במונחים של שונות. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של טרי 2X YT בינוני ל 150 מילימטר צלחות כדי לאסוף את החיידקים.ואז לקצור את החיידקים באמצעות מגרד סטרילי. לאחר ערבוב יסודי, מוסיפים 20% גליצרול ומשאירים במינוס 80 מעלות צלזיוס באליקוטים לשימוש עתידי. לשימוש מיידי, בצע ערכת מיצוי פלסמיד מבוססת עמודה כדי לטהר את הדנ"א הפלסמיד מאחד האליקוצים של הספרייה לפני הוספת גליצרול.למדוד את הריכוז של ה-DNA בספקטרופוטומטר UV ולאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש. השתמש 2.5 microliters של הספרייה כתבנית DNA עבור הגברה PCR. הגדר את תנאי התרמוצ'ילר והתחל את הריצה.לאחר מכן, השתמש בערכת PCR של אינדקס כדי לבצע PCR אינדקס. פעולה זו תרצף את הספריות הכפולות הכלולות באינדקס בתוך הפעלת אילומינה מרובת ערכים. לאחר מכן הגדר את תנאי התרמוצ'ילר והתחל את הריצה.לאחר טיהור עם חרוזים AMPure XP, כדי לאמת את הגודל, להפעיל microliter אחד של אחד עד 10 דילול של הספרייה הסופית על bioanalyzer. לאחר מכן כימת על-ידי בחירת האזור של המעקב אחר הספריה הסופית. ייצוגים סכמטיים אלה דמוניזציה כי לאחר שיבוט לתוך וקטור מסנן P, רק מושבות המתאימות ORFs לייצר בטא לקטם פונקציונלי בנוכחות אנטיביוטיקה.לאחר סינון צפויה ירידה במספר השיבוטים של פי 20. עם ORFs תיקייה טובה גדל בריכוזים אנטיביוטיים גבוהים יותר. יתר על כן, ניתן לשחזר בקלות את שברי ORF מהספריה המסוננת.ספריית ORF של פאגמיד בנויה כדי לבצע בחירת תצוגת פאג' נגד חלבוני מטרה או נוגדנים. כל הספריות והפלטים המתקבלים מנותחים עמוקות על ידי ה- NGS. ה- NGS מספק מידע מלא על מגוון הספריות, שפע ומיפוי מדויק של כל אחד מהקטעים שנבחרו.לבסוף האינטראקטיביות לחפש webtool שפותחה מייצרת קריאות רצף גלם החל ברשימה של תחומים putative עם ביאורים גנומיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבנות ולאמת ספריית דומיין ממקור DNA הרצוי. ולבצע הקרנת תפוקה גבוהה של הספרייה על ידי רצף הדור הבא.יש לנו אופטימיזציה של רצף של ספריות סינון ORF עם פלטפורמות Illumina ופיתחנו webtool המאפשרים ניתוח של סוג זה של נתונים ללא כל צורך של כישורי תכנות.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...