Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra den italienske utdannings- og University (2010P3S8BR_002 til CP).

1. bygging av ORF biblioteket (figur 1)
<ol><li>Utarbeidelse av sett inn DNA
	<ol>
<li>
Fragmenter forberedelse fra syntetisk eller genomisk DNA
		<ol>
<li>Pakke/rense DNA bruker standard metoder26.</li>
			<li>Fragment DNA av sonication. Hvis bruker en standard sonicator, som en generell forslag start med 30 s pulser på 100% utgangseffekt. Merk: Piloten eksperimenter bør gjøres med forskjellige og sonication ganger for å ang...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Etableringen av et høykvalitets svært variert ORFs filtrert bibliotek er første viktige skritt i hele prosedyren siden det vil påvirke alle påfølgende trinnene i rørledningen.
En viktig fordel funksjon i vår metode er at noen kilde (intronless) DNA (cDNA, genomisk DNA, PCR avledet eller syntetiske DNA) er egnet for biblioteket konstruksjon. Den første parameteren som bør tas i betraktning er at lengden på DNA fragmenter klonet inn pFILTER vektor bør gi en representasjon av hele sam...

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode og utvalg av biblioteker av brettet og løselig protein domener fra alle genic/genomisk Start kilde. Tilnærmingen kombinerer tre ulike teknologier: phage display, bruk av folding journalist og neste generasjons sekvensering (NGS) med en bestemt web-verktøy for dataanalyse. Metoder kan brukes i mange forskjellige sammenhenger protein-basert forskning, for identifikasjon og merknad av nye proteiner/protein domener, karakterisering av strukturelle og funksjonelle egenskaper kjent proteiner, samt definisjon av protein-interaksjon nettverk.
Mange åpne spørsmål er fremdeles på protein-basert forskning og utviklingen av metoder for optimal protein produksjon er et viktig behov for flere felt for undersøkelse. Til tross for at tusenvis av prokaryotic og eukaryotic genomer1er for eksempel et tilsvarende kart over den relative proteomes med en direkte merknad kodet proteiner og peptider fremdeles mangler det store flertallet av organismer. Katalogen komplett proteomes fremstår som et utfordrende mål krever en stor innsats i form av tid og ressurser. Gullstandarden for eksperimentell merknaden forblir kloning av alle åpne lesing rammer (ORFs) av et genom, bygge den såkalte "ORFeome". Gen funksjon tilordnet vanligvis basert på homologi til beslektede gener kjent aktivitet men denne tilnærmingen er dårlig nøyaktig på grunn av tilstedeværelsen av mange feil merknader i referanse databaser2,3,4, 5. Videre selv for proteiner som er identifisert og kommentert, ytterligere studier er nødvendig for å oppnå karakteristikk i overflod, uttrykk mønstre i forskjellige sammenhenger, inkludert strukturelle og funksjonelle egenskaper samt samhandling nettverk.
Videre siden proteiner er sammensatt av forskjellige domener, hver av dem viser bestemte funksjoner og annerledes bidrar til protein funksjoner, studien og den nøyaktige definisjonen av disse domenene kan tillate en mer helhetlig bilde, både på singelen Gene og på full genomet nivå. Alle opplysningene nødvendig gjør protein-basert forskning et bredt og utfordrende felt.
I dette perspektivet, kan et viktig bidrag gis av objektivt og høy gjennomstrømming metoder for protein produksjon. Imidlertid er suksessen til slike tilnærminger, foruten den betydelig investeringen som kreves, avhengig av evnen til å produsere løselig/stabil protein konstruksjoner. Dette er en begrensende faktor siden det har blitt anslått at bare ca 30% av protein kan være uttrykt og produsert på tilstrekkelige nivåer skal eksperimentelt nyttig6,7,8. En tilnærming for å overkomme denne begrensningen er basert på bruk av tilfeldig fragmentert DNA til å produsere ulike polypeptides, som sammen gir overlappende fragment representasjon av enkelte gener. Bare en liten prosentandel av tilfeldig generert DNA fragmenter er funksjonelle ORFs mens det store flertallet av dem er ikke-fungerende (av stopp kodon inne deres sekvenser) eller kode for fjern naturlig (ORF i en annen ramme enn opprinnelige) polypeptides uten biologiske mening.
Hvis du vil løse alle disse problemene, har vår gruppe utviklet en høy gjennomstrømming protein uttrykk og samhandling analyse plattform som kan brukes på en genomisk skala9,10,11,12. Denne plattformen integrerer følgende teknikker: 1) en metode for å velge samlinger av riktig foldet protein domener fra koding delen av DNA fra noen organismer; 2) den phage teknologien for å velge partnere samhandlinger; 3) NGS helt karakterisere det hele interactome under studien og identifisere kloner steder. og 4) en web-verktøy for dataanalyse for brukere uten bioinformatikk eller programmering ferdigheter til å utføre Interactome-Seq analyse på en enkel og brukervennlig måte.
Bruk av denne plattformen har viktige fordeler over alternative strategier for undersøkelse; fremfor alt er metoden fullstendig upartiske høy gjennomstrømming og modulære studie fra ett gen til et hele genom. Det første trinnet i rørledningen er etableringen av et bibliotek fra tilfeldig fragmentert DNA under studien, som er så dypt preget av NGS. Dette biblioteket er generert ved hjelp en konstruert vektor der gener/fragmenter av interesse er klonet mellom en signal sekvens for protein sekresjon i periplasmic plass (dvs., sek leder) og TEM1 β-lactamase genet. Fusion protein vil tildele ampicillin motstand og evne til å overleve under ampicillin press hvis klonet fragmenter er i-ramme med både disse elementene og resulterende fusion protein er riktig brettet10,13 ,14. Alle kloner reddet etter antibiotikumet utvalg, den såkalte "filtrerte kloner", er ORFs og et stort flertall av dem (mer enn 80%), er avledet fra virkelige gener9. Dessuten ligger kraften i denne strategien i funnene at alle ORF filtrert kloner er koding for riktig kastet/løselig proteiner/domener15. Som mange kloner, finnes i biblioteket og kartlegging i samme område/domene, har ulike start- og sluttpunkt, gjør dette objektiv, enkeltsteg identifikasjon av minimum fragmenter som gir løselig produkter.
En ytterligere bedring i teknologien er gitt ved bruk av NGS å karakterisere biblioteket. Kombinasjonen av denne plattformen og en bestemt web-verktøy for dataanalyse gir viktig upartisk informasjon på den eksakte nukleotid sekvenser og plasseringen av valgte ORFs på referansen DNA under studien uten behov for ytterligere omfattende analyser eller eksperimentell innsats.
Domainome biblioteker kan overføres til en utvalg sammenheng og brukes som en universell instrument til å utføre funksjonelle studier. Høy gjennomstrømming protein uttrykk og samhandling analyse plattformen at vi integrert og at vi kalt Interactome-Seq drar fordel av den phage teknologien ved å overføre den filtrerte ORF til en phagemid vektor og opprette en phage-ORF bibliotek. En gang re klonet til en phage visning sammenheng, protein domener vises på overflaten av M13 partikler; på denne måten kan domainome biblioteker være direkte valgt for genet fragmenter koding domener med bestemt enzymatisk aktiviteter eller bindende egenskaper, slik at interactome nettverk profilering. Denne tilnærmingen ble først beskrevet av Zacchi et al. 16 og senere brukt i flere andre sammenheng13,17,18.
Sammenlignet med andre teknologier som brukes til å studere protein-protein interaksjon (inkludert gjær to hybrid systemet og massespektrometri19,20), er en stor fordel forsterkning av bindende partneren som oppstår under phage vise flere runder med valg. Dette øker utvalg følsomhet dermed gir IDen til lav rikelig bindende proteiner domener i biblioteket. Effektiviteten av utvalget med ORF-filtrert biblioteket er ytterligere økt av ikke-fungerende kloner. Til slutt, teknologien tillater valg skal utføres mot både protein og ikke-protein agn21,22,23,24,25.
Phage valg ved hjelp av domainome-phage-biblioteket kan utføres ved hjelp av antistoffer kommer fra sera av pasienter med ulike pathological betingelser, f.eks autoimmune sykdommer13, kreft eller infeksjon sykdommer som agn. Denne tilnærmingen til å oppnå den såkalte "antistoff signaturen" av sykdom under studien tillater massivt identifisere og karakterisere antigener/epitopes spesielt gjenkjennes av pasientens antistoffer samtidig. Sammenlignet med andre metoder for bruk av phage kan identifikasjon av både lineære og conformational antigenic epitopes. Identifikasjon av en bestemt signatur potensielt kan ha en betydelig innvirkning på forståelse patogenesen, ny vaksine design, identifisering av nye terapeutiske mål og utvikling av nye og spesifikke diagnostiske og prognostiske verktøy. Videre når studien er fokusert på smittsomme sykdommer, er en stor fordel at oppdagelsen av immunogenic proteiner er uavhengig av patogen dyrking.
Vår tilnærming bekrefter at folding reporterne kan brukes i genomisk skala velge "domainome": en samling av riktig brettet, vel uttrykt, løselig protein domener fra koding delen av DNA og/eller cDNA fra en organisme. Når isolerte proteinfragmenter er nyttig for mange formål, gir viktig eksperimentelle informasjon for genet merknaden samt for strukturelle studier, antistoff epitope kartlegging, antigen identifikasjon, etc. Fullstendigheten av høy gjennomstrømming data NGS gir analyse av komplekse utvalgene, for eksempel phage skjerm biblioteker, og har potensial til å omgå den tradisjonelle arbeidskrevende plukkingen og testing på individuelle phage reddet kloner.
Samtidig takket være funksjonene av filtrerte biblioteket og ekstreme følsomhet og makt NGS analysen er det mulig å identifisere protein domenet ansvarlig av hver interaksjon direkte i en første skjermen, uten å måtte opprette flere biblioteker for hver bundet protein. NGS kan få en omfattende definisjon av hele domainome av alle genic/genomisk Start kilder og data analyse web verktøyet gjør det mulig for obtainment av svært spesifikke karakteristikk både fra en kvalitativ og kvantitativ synspunkt av den interactome proteiner domener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Sammenleggbar journalister er proteiner med lett identifiserbare fenotyper, som antibiotikaresistens, som folding og funksjonen settes da smeltet til dårlig folding proteiner eller tilfeldig åpent lesing rammer. Vi har utviklet en strategi der bruker TEM-1 β-lactamase (enzymet overdragelse ampicillin motstand) på en genomisk skala, vi kan velge samlinger av riktig foldet protein domener fra koding delen av DNA av alle intronless genom. Proteinfragmenter innhentet av denne tilnærmingen, den såkalte "domainome", vil være godt uttrykt og løselig, noe som gjør dem velegnet for strukturelle/funksjonelle studier.
Kloning og viser "domainome" direkte i et phage display system, har vi viste at det er mulig å velge bestemt protein domener med ønsket bindingsegenskapene (f.eks andre proteiner eller antistoffer) gir viktig eksperimentell informasjon for genet merknaden eller antigen identifikasjon.
Identifikasjon av de mest beriket Klonene i en valgt polyklonale befolkning kan oppnås ved hjelp av romanen neste generasjons sekvensering teknologi (NGS). For disse grunner introduserer vi dypt sekvensering analyse av biblioteket selv og utvalg-utganger for å gi fullstendig informasjon om mangfold, overflod og presis kartlegging av hver av valgte fragment. Protokollene presenteres her viser de viktigste trinnene for biblioteket konstruksjon, karakterisering og validering.

Filtrering tilnærming er schematized i figur 1. Hver type intronless DNA kan brukes. Den første delen av filtrering tilnærming representeres i figur 1A : etter lasting på en agarose gel eller en bioanalyzer, en god fragmentering av DNA av interesse vises som en smear av fragmenter med en lengde distribusjon i ønsket størrelse 150-750 bp. En representant virtuelle gel bilde av fragmentert DNA innhentet er gitt. Fragmenter la...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: En protokoll for Domainome biblioteket konstruksjon, validering og utvalg av Phage Display og neste generasjons sekvensering

Protokollene beskrevet tillater bygging, karakterisering og utvalg (mot målet valgfrihet) av et "domainome" bibliotek laget av noen DNA-kilde. Dette oppnås ved en forskning rørledningen som kombinerer forskjellige teknologier: phage skjerm, folding journalist og neste generasjons sekvensering med en web-verktøy for dataanalyse.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i proteinbasert forskning som merknad av nye proteiner eller proteindomener, karakterisering av strukturelle og funksjonelle egenskaper av kjente proteiner, definisjon av proteininteraksjonsnettverk eller antistoffsignaturer under forskjellige forhold. Den største fordelen med denne teknikken er at den er helt objektiv, høy gjennomstrømning og modulær for enhver form for studie som spenner fra et enkelt gen til et helt genom. Byggingen av et domainone bibliotek er svært nyttig for funksjonelle studier.Det kan overføres til en phage display kontekst og brukes for valg mot ulike mål som bindende proteiner eller renset antistoffer. Koblingen med NGS muliggjør en ekstremt følsom og kraftig analyse. Samtidig gir webverktøyene som er spesielt utviklet, en presis karakterisering av hele domainomet og interactome.For å konstruere ORF-biblioteket først, sonikere DNA med 30 sekunders pulser ved 100% utgang. Etter sonikering, last stigen og det sonikerte DNA på en 1,5% agarose gel. Start deretter elektroforeseenheten på fem volt per centimeter i 15 minutter.Agarose gel elektroforese viser tilstedeværelsen av DNA smøre bekrefter sonikering. Dette er i forhold til det solide båndet hentet fra et DNA som ikke er utsatt for sonikering. Klipp deretter geldelen med det fragmenterte DNA-smøret og rens ved hjelp av kolonnebasert gelekstraksjonssett.Mål konsentrasjonen av det rensede DNA-et i UV-spektrofotometeret. Følg deretter produsentens instruksjoner og behandle fem mikrogram av innsatsen med en mikroliter rask blunting enzymblanding. Inaktiver deretter enzymblandingen ved 70 grader Celsius i 10 minutter.For å forberede filtreringsvektoren må du først fordøye fem mikrogram av den rensede kloningvektoren med EcoRV-begrensningsenzym. Last deretter de fordøyde og ufordøyde vektorene og den molekylære markøren på en 1% agarose gel. Deretter inaktiverer du restriksjonsenzymet ved 80 grader Celsius i 20 minutter.Deretter fosforyler den fordøyde vektoren med fem enheter fosfataseenzym og 1/10-volumet av 10X fosfatasebufferen. Inkuber deretter blandingen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Deretter inaktiver fosfataseenzymet ved 65 grader Celsius i fem minutter.Deretter trekker du ut plasmiden fra gelen og renser DNA. Mål deretter konsentrasjonen av DNA i UV-spektrofotometeret. For å utføre ligationreaksjonen, legg til 400 nanogram av fosforylertinnsatser til ett mikrogram fordøyd vektor, 10X T4 DNA ligase buffer og T4 DNA ligase til et endelig volum på 100 mikroliter.Deretter inkubere ligation reaksjonen på 16 grader Celsius for over natten. Neste dag, varme inaktivere ligase på 65 grader Celsius i 10 minutter. Deretter legger du til 1/10 volum av tre molarnatriumacetat ved pH 5.2 og 2,5 volumer på 100% etanol for å utløse ligationproduktet.For å utløse DNA, bland reagensene og frys ved minus 80 grader Celsius i 20 minutter. Etter 20 minutter, sentrifuge på høyeste hastighet i 20 minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, utvise supernatant.Til pellet, tilsett 500 mikroliter kald 70% etanol og igjen sentrifuge. Kast supernatanten på slutten av sentrifugeringen. Når pelleten er lufttørket, oppløs det utfelte DNA i 10 mikroliter vann.Før du utfører elektroporasjon, sørg for riktig antall mikrocentrifuge rør og 0,1 centimeter elektroporasjon cuvettes på is. Tilsett deretter en mikroliter av det rensede ligationproduktet til 25 mikroliter av cellene. Deretter pipetter DNA, celleblanding til den kalde elektroporasjon cuvette og knipse røret.Tørk deretter av vannet fra utsiden av cuvette og plasser i elektroporasjonsenheten og trykk puls. Etter at elektroporasjonen er over, legg raskt til en milliliter flytende 2X YT-medium uten antibiotika til cellene i cuvette. Deretter overfører du cellulærblandingen til et 10 milliliter rør.La røret stå på en shaker ved 220 omdreininger per minutt ved 37 grader Celsius i en time. Plate fortynninger av biblioteket på 10 centimeter 2X YT agar plater supplert med kloramfenikol, ampicillin og bare kloramfenikol. Dette er for å få enkeltkolonier som skal testes av PCR og å utføre titrering.Deretter plate de forvandlede kompetente celler på 15 centimeter 2X YT agar plater supplert med kloramfenikol og ampicillin. Deretter inkubere platene ved 30 grader Celsius for over natten. Neste dag teller koloniene som velger fortynningen der de kan telles.Beregn deretter bibliotekstørrelsen. Bibliotekstørrelse beregnes som følger, gjennomsnittlig koloni antall ganger fortynning faktor ganger totalt bibliotekvolum. Bibliotekstørrelse bør være i rekkefølge av 10 til kraften av seks kloner.Hvis ampicillinkonsentrasjon er optimal for å utføre mer filtrering, reduserer klonenummeret til en til 20 av det som oppnås i fravær av dette antibiotika. For å teste for de positive koloniene, bruk et tips for å plukke opp rundt 15 til 20 enkle kolonier. Deretter fortynne koloniene med 100 mikroliter av 2X YT medium uten antibiotika.Deretter forsterker PCR 0,5 mikroliter av kulturen som DNA-mal med Taq DNA-polymerase. Under PCR, kjøre 25 sykluser av forsterkninger ved hjelp av glødetemperatur på 55 grader Celsius og en forlengelsestid på 40 sekunder ved 72 grader Celsius. Kontroller at lengden på innsatsen er i det forventede området 150 til 750 basispar.Og at forskjellige kolonier presenterer forskjellige innsatser med forskjellig størrelse. Dette indikerer et godt bibliotek forberedelse i form av variasjon. Deretter legger du til tre milliliter med ferskt 2X YT-medium til 150 millimeterplatene for å samle bakteriene.Høst deretter bakteriene ved hjelp av en steril skrape. Etter å ha blandet grundig, tilsett 20% glyserol og la i minus 80 grader Celsius i aliquots for fremtidig bruk. For umiddelbar bruk, utfør kolonnebasert plasmidekstraksjonssett for å rense plasmid-DNA fra en av aliquots av biblioteket før du legger til glyserol.Mål konsentrasjonen av DNA i UV-spektrofotometeret og oppbevar deretter prøvene ved minus 20 grader Celsius til bruk. Bruk 2,5 mikroliter av biblioteket som DNA-mal for PCR-forsterkning. Still inn termocyclerforholdene og start løpeturen.Deretter bruker du et indeks-PCR-sett til å utføre indeks-PCR. Dette vil sekvensere de dobbeltindekserte bibliotekene i multipleksed Illumina kjører. Still deretter inn termocyclerforholdene og start løpeturen.Etter rensing med AMPure XP perler, for å bekrefte størrelsen, kjøre en mikroliter av en til 10 fortynning av det endelige biblioteket på bioanalyzer. Kvantifisere ved å velge regionen for det endelige biblioteket spor. Disse skjematiske representasjoner demonstate at etter kloning i P filter vektor, bare kolonier som svarer til ORFs produsere funksjonell beta-laktamase i nærvær av antibiotika.Etter filtrering forventes en reduksjon i klonenummeret på 20 ganger. Med god mappe ORFs vokser ved høyere antibiotikakonsentrasjoner. Videre kan ORF-fragmentene enkelt gjenopprettes fra det filtrerte biblioteket.En phagemid ORF bibliotek er konstruert for å utføre phage display valg mot målproteiner eller antistoffer. Alle bibliotekene og de oppnådde utgangene analyseres deretter dypt av NGS. NGS gir en fullstendig informasjon om bibliotekmangfold, overflod og presis kartlegging av hvert av de valgte fragmentene.Endelig genererer interactome søke webtool utviklet rå sekvensering leser som spenner til listen over antatte domener med genomiske merknader. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du konstruerer og validerer et domainome bibliotek fra en ønsket DNA-kilde. Og for å utføre en høy gjennomstrømning screening av biblioteket ved neste generasjon sekvensering.Vi har optimalisert sekvenseringen av ORF-filtreringsbibliotekene med Illumina-plattformene og utviklet en webverktøy som gjør det mulig å analyse av denne typen data uten behov for programmeringsferdigheter.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokoll for Fag Display og Affinitetsutvelgelse Bruke rekombinante protein agn

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Neste-generasjons sekvensering av 16S ribosomalt RNA Gene amplikonene

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA Metylering Analyse av Neste-generasjons sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3 slutten sekvensering biblioteket forberedelser med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tick Microbiome karakterisering av neste generasjons 16S rRNA Amplicon sekvenser

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...